超聲輔助提取的五色梅中總黃酮含量測(cè)定

超聲輔助提取的五色梅中總黃酮含量測(cè)定

黃酮類化合物對(duì)各種生物活性很有吸引力。如槐花米中的蘆丁和血橙皮中的橙皮甙具有維生素P樣作用,能維持血管正常滲透壓,減低血管的脆性。葛根中的葛根黃酮和銀杏中的銀杏黃酮,具有擴(kuò)張冠狀血管作用。五色梅(LantanacamaraL.)為馬鞭草科馬纓丹屬一年生或多年生半藤本狀灌木,具有清熱解毒、散解止痛、祛風(fēng)止癢的功效,能治感冒高熱、痢疾、肺結(jié)核等病癥。莖葉煎湯洗治濕疹、皮炎,搗爛敷患處能治跌打筋傷。有關(guān)生物活性研究表明,該植物粗提物表現(xiàn)出驅(qū)蟲殺蟲活性、抗菌抗病毒活性等。該植物精油具有抗菌和細(xì)胞毒活性,但其化學(xué)組成隨著植物樣品采集時(shí)間和地點(diǎn)不同而不同。另外,國(guó)內(nèi)外研究者還系統(tǒng)研究了該植物的化學(xué)成分,不僅發(fā)現(xiàn)了許多新的萜類和萘醌類等化合物,也發(fā)現(xiàn)了新的黃酮類化學(xué)成分,比如Camaraside、Linaroside、Lantanoside、Camaroside和3-methylquercertin。本試驗(yàn)首次通過(guò)分光光度法測(cè)定了五色梅根、莖、葉、果和花中總黃酮的含量,并評(píng)價(jià)了其清除羥基自由基的活性。1材料和方法1.1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備五色梅根、莖、葉、果和花樣品于2013年12月采集于佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院北院校區(qū),根據(jù)文獻(xiàn)鑒定為五色梅。新鮮五色梅根、莖、葉、果和花用去離子水洗凈、風(fēng)干、粉碎,備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液(精確稱取15mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)試劑,用70%乙醇溶解并定容至100mL)。95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸均為分析純。UV-2501PC型紫外-可見吸收光譜儀(日本島津公司)。1.2方法1.2.1抗風(fēng)險(xiǎn)活性的提取準(zhǔn)確稱取5g五色梅根干燥粉末,加入100mL70%乙醇,在溫度為50℃和功率為90Hz條件下超聲提取3次,每次4h。70%乙醇提取液過(guò)濾合并,濾渣再加100mL70%乙醇加熱回流提取1次,提取時(shí)間2h。超聲提取和加熱回流提取的乙醇溶液合并,于50℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至約50mL。濃縮提取液轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶,用70%乙醇定容,得到五色梅根總黃酮待測(cè)液。五色梅莖、葉、果和花的總黃酮提取按同法操作。1.2.2熒光現(xiàn)象的測(cè)定1)熒光試驗(yàn)。分別取1mL五色梅根、莖、葉、果和花待測(cè)液,在沸水浴上蒸干,加入硼酸的飽和丙酮溶液以及10%枸櫞酸丙酮溶液各1mL,繼續(xù)蒸干。將殘?jiān)谧贤鉄粝抡丈?觀察熒光現(xiàn)象。2)氨顯色反應(yīng)。將五色梅根、莖、葉、果和花待測(cè)液各滴于濾紙上,風(fēng)干后用氨氣熏蒸,觀察顏色變化。1.2.3線性關(guān)系的測(cè)定精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00mL置于25mL容量瓶中,加入70%乙醇至10mL,搖勻,加50g/L亞硝酸鈉溶液0.7mL,搖勻后放置6min,再加100g/L硝酸鋁溶液0.7mL,搖勻后放置6min,再加入40g/L氫氧化鈉溶液5mL,用70%乙醇定容至25mL,搖勻后放置10min。以70%乙醇為空白對(duì)照,在420~600nm內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描,測(cè)定其最大吸收波長(zhǎng)。線性回歸方程的建立:分別精確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0~10mL于25mL容量瓶中,梯度1mL,加入70%乙醇至10mL,然后按測(cè)定波長(zhǎng)的方法操作,在505nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定其吸光度。精確移取“1.2.1”五色梅根待測(cè)液1.5mL置于25mL容量瓶中,加70%乙醇至10mL,然后按測(cè)定波長(zhǎng)的方法操作,在505nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值,3次平行,取平均值帶入線性回歸方程,計(jì)算總黃酮含量。五色梅莖、葉、果和花待測(cè)液總黃酮含量按相同方法測(cè)定。采用加樣法進(jìn)行回收率的測(cè)定。分別精確移取“1.2.1”五色梅根、莖、葉、果和花待測(cè)液各1、2、3mL置于25mL容量瓶中,加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1mL,再按樣品總黃酮含量測(cè)定方法測(cè)定其吸光度值,計(jì)算回收率。1.2.4“1.2.1”五水梅根待測(cè)液制備工藝移取2mmol/L硫酸亞鐵1mL于10mL刻度試管中,加入6mmol/L雙氧水1mL,搖勻后加入6mmol/L水楊酸1mL,搖勻,置于37℃水浴恒溫15min,立即測(cè)定其吸光度值,記為A0。然后精確移取“1.2.1”五色梅根待測(cè)液1~7mL加入試管,加水至10mL,搖勻,靜置10min,立即測(cè)其吸光度值,記為Ax。計(jì)算羥基自由基清除率。羥基自由基清除率=[(A0-Ax)÷A0]×100%五色梅莖、葉、果和花待測(cè)液清除羥基自由基的活性按相同的方法操作。2結(jié)果與分析2.1黃酮的定性分析2.1.1黃酮和黃酮蚤的檢測(cè)五色梅根、莖、葉、果和花提取液反應(yīng)殘?jiān)谧贤鉄粝抡丈渚^察到強(qiáng)烈的熒光現(xiàn)象,表明提取液含有黃酮或黃酮甙。這是黃酮類化合物的典型反應(yīng)。2.1.2黃酮類化合物五色梅根、莖、葉、果和花提取液滴于濾紙上風(fēng)干后經(jīng)氨氣熏蒸后,立刻呈現(xiàn)亮黃色,紫外燈下照射觀察更為明顯。氨氣熏蒸后放置一段時(shí)間,顏色因氨氣揮發(fā)而褪色。這是黃酮類化合物的典型特征。熒光試驗(yàn)和氨顯色反應(yīng)結(jié)果均表明五色梅根、莖、葉、果和花的提取液中含有黃酮或其甙類。2.2最小二乘法擬合線性通過(guò)波長(zhǎng)掃描,獲得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長(zhǎng)為505nm,故確定505nm為測(cè)定波長(zhǎng)。以蘆丁濃度(C)為橫坐標(biāo),吸光度(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)最小二乘法進(jìn)行線性擬合,得到線性回歸方程為A=0.01054C+0.02423,R2=0.99221。將五色梅根、莖、葉、果和花待測(cè)液在505nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度(A)代入線性回歸方程,計(jì)算待測(cè)液中總黃酮含量并換算成每克生藥干粉樣品中的總黃酮含量,結(jié)果見表1。表1結(jié)果表明,五色梅花的總黃酮含量最高,達(dá)6.16%,其次是葉,含量為3.54%,然后是莖和果,含量分別為1.76%和1.17%,根中的總黃酮含量最少,為0.18%。2.3合成有色物質(zhì)參照Fenton反應(yīng)的方法建立反應(yīng)體系模型,利用雙氧水與二價(jià)鐵離子混合后產(chǎn)生的羥基自由基,但羥基自由基反應(yīng)活性強(qiáng),存活時(shí)間短,若在反應(yīng)體系中加入水楊酸,能有效地捕捉羥基自由基并生成有色物質(zhì)。該物質(zhì)在波長(zhǎng)510nm處有強(qiáng)吸收,若加入具有清除羥基自由基活性的樣品,則會(huì)與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)羥基自由基,從而減少有色物質(zhì)的生成量。采用固定時(shí)間法,在波長(zhǎng)510nm處測(cè)定樣品反應(yīng)液的吸光度,并與未加入樣品的空白液的吸光度比較,根據(jù)公式計(jì)算出樣品對(duì)羥基自由基的清除率。試驗(yàn)結(jié)果見圖1。從圖1可以看出,五色梅根、莖、葉、果和花的乙醇提取液均表現(xiàn)出一定程度的羥基自由基清除活性,而且隨著提取液體積的增加,活性也逐漸增強(qiáng)。其中五色梅葉的乙醇提取液活性最強(qiáng),并且隨著提取液體積的增加,其活性更強(qiáng)。3樣品活性測(cè)定以70%乙醇為溶劑,聯(lián)合運(yùn)用超聲輔助和加熱回流法提取了五色梅根、莖、葉、果和花樣品中的總黃酮。采用分光光度法,以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照,在505nm波長(zhǎng)下測(cè)定了五色梅樣品中的總黃酮含量,結(jié)果五色梅花的總黃酮含量最高,其次是葉,根的總黃酮含量最少?；厥章试囼?yàn)結(jié)果表明該方法可靠。采用分光光度法測(cè)定了五色梅70%乙醇提取液樣品對(duì)羥基自由基的清除活性,結(jié)果顯示五色梅根、莖、葉、果和花樣品乙醇提取液均具有一定程度的羥基自由基清除活性,且其活性均隨著提取液加入量的增加而變強(qiáng),其中葉提取液的清除作用最強(qiáng),其次是花,然后依次是莖、果和根。分析樣品總黃酮含量和清除自由基活性效果后發(fā)現(xiàn),羥基自由基清除率與樣品中總黃酮含量不呈正比關(guān)系,原因是提取液樣品中除了含有具有羥基自由基清除作用的黃酮類化合物之外,還含有具有同樣作用的