火棘葉中黃酮類化合物提取工藝的研究

火棘葉中黃酮類化合物提取工藝的研究

刺是薔薇科植物。它也被稱為營養(yǎng)植物、救贖食品、紅子、赤陽子等。水果、葉子和根莖也可以用作藥物?；鸺偺崛∥锞哂星宄踝杂苫?、降血脂、增強(qiáng)免疫力、增強(qiáng)體力和促進(jìn)消化功能等作用。對(duì)于火棘的研究,目前大多限于對(duì)營養(yǎng)成分、藥用成分的測定,而黃酮類化合物的提取研究未見報(bào)道。本文對(duì)火棘黃酮類化合物的提取方法進(jìn)行了研究,為火棘資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。同時(shí),利用微乳薄層色譜法對(duì)火棘果實(shí)、葉子的黃酮類化合物進(jìn)行分離鑒定,為該黃酮類物質(zhì)的分離鑒定提供了準(zhǔn)確、簡便、有效的方法。1材料和方法1.1材料表面火棘葉、果實(shí)于2001年9月采自西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院校區(qū),于60℃烘干,粉碎至60～80目,裝袋備用。1.2超聲材料和設(shè)備754型紫外-可見分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠);超級(jí)恒溫槽(CS501型);色譜用聚酰胺薄膜(臺(tái)州四青生化材料廠);點(diǎn)樣毛細(xì)管(華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠);H6605T型超聲波發(fā)生器(無錫超聲電子設(shè)備廠)。蘆丁、槲皮素(中國藥品生物制品鑒定所)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。丙酮、甲醇、乙醇、正丁醇、正庚烷、甲酸、三氯化鋁、硝酸鋁等均為AR;十二烷基硫酸鈉(SDS)為CR。1.3方法1.3.1酮類化合物的提取為了消除火棘果色素的影響,實(shí)驗(yàn)以火棘葉為原料,研究火棘黃酮類化合物的提取方法。準(zhǔn)確稱取已粉碎的火棘葉粉末5.0g,置于磨口三頸燒瓶中,加入一定量的不同濃度的提取劑,在不同溫度、時(shí)間、料液比等條件下回流提取,以確定最佳提取條件。1.3.2由微乳液組成的準(zhǔn)備按照參考文獻(xiàn)進(jìn)行。1.3.3標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備稱取對(duì)照品適量,分別配制成含蘆丁2mg/mL,槲皮素0.5mg/mL的乙醇溶液,作為對(duì)照品溶液。1.3.4沙棘果實(shí)溶液的制備稱取適量已粉碎的火棘果粉末,加入70%乙醇5mL,超聲波振蕩0.5h,濾液作為微乳色譜分離鑒定的試液。1.3.5微乳液中聚酰胺薄膜的制備分別用點(diǎn)樣毛細(xì)管吸取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液,火棘葉溶液,火棘果溶液,在聚酰胺薄膜上點(diǎn)樣,直徑為1～2mm,用配制好的微乳液為展開劑,室溫下展開10cm,取出晾干,置于365nm紫外燈下檢測。1.3.6黃酮含量測定按參考文獻(xiàn)進(jìn)行。2結(jié)果與分析2.1提取條件的確定2.1.1提取溶劑的選擇黃酮類化合物無論是游離的黃酮甙元還是黃酮甙都易溶于甲醇、乙醇、丙酮中。采用不同濃度的甲醇、乙醇、丙酮3種溶劑進(jìn)行提取,在提取溫度、時(shí)間等相同的條件下,結(jié)果由圖1可見,丙酮的提取效果較甲醇和乙醇好,其中50%的丙酮的提取效果最好。乙醇的提取效果又較甲醇好。當(dāng)乙醇的濃度為70%時(shí),效果最好,此后隨著濃度增加,吸光度(即提取率)降低;而當(dāng)乙醇濃度低于30%時(shí),過濾困難。2.1.2提取溫度對(duì)黃酮類化合物濃度的影響以70%的乙醇為溶劑,在提取時(shí)間、料液比相同的條件下,改變提取溫度(圖2)。由圖2可知,溫度升高,黃酮類化合物在乙醇中的溶解度增加,提取效果好。但當(dāng)溫度過高(超過80℃)時(shí),會(huì)使其中的活性成分破壞,雜質(zhì)的溶出量增加,還會(huì)造成溶劑揮發(fā)損失。2.1.3提取時(shí)間的確定以70%的乙醇為溶劑,在其它條件相同的情況下,改變提取時(shí)間其提取效果由圖3可見,提取率隨提取時(shí)間的延長而增加,但2h后變化不大。因?yàn)檫@時(shí)黃酮類物質(zhì)已基本上全部溶出,因此提取時(shí)間以2h為宜。從實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn),若在提取回流以前先用70%乙醇浸泡一段時(shí)間,有利于提高黃酮的提取率,縮短提取時(shí)間。2.1.4料液比對(duì)提取率的影響在其它條件相同的情況下,不同料液比對(duì)提取效果有一定的影響。由圖4可知,隨著料液比(W∶V)的增大,提取率增加。當(dāng)料液比大于1∶8以后,隨料液比的增加,提取率增加緩慢。從提取效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷等方面綜合考慮,選用1∶8的料液比較合適。2.2數(shù)據(jù)分析及結(jié)果在以上單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,對(duì)影響火棘葉黃酮類化合物提取效果的因素:提取溫度、提取次數(shù)、提取時(shí)間、料液比進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn),并對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(9組實(shí)驗(yàn)的吸光度分別為:1.124、1.136、1.082、1.221、1.296、1.246、1.107、1.283、1.152)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析(表1、2)。從表2中看出,4個(gè)因子對(duì)提取效果影響的大小順序是:提取溫度>乙醇濃度>提取時(shí)間>料液比。上述結(jié)果表明,提取溫度對(duì)火棘葉總黃酮浸出效果影響最大,溫度越高提取效果越好;其次是乙醇濃度對(duì)提取效果的影響,乙醇濃度越高提取效果越好,但是根據(jù)前面單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,當(dāng)乙醇的濃度為70%時(shí),效果最好,此后隨著濃度增加,吸光度降低;增加提取時(shí)間,可以提高提取效果;火棘葉質(zhì)量與溶劑的比例對(duì)提取有一定的影響,增加料液比有利于火棘葉黃酮的浸出,但料液比過大不僅增加溶劑消耗而且回收難度大。根據(jù)單因子實(shí)驗(yàn)結(jié)果和正交試驗(yàn)結(jié)果綜合分析可知,火棘葉黃酮的最佳提取條件為:溶劑為70%乙醇,火棘葉質(zhì)量與溶劑體積比為1∶8,在80℃條件下回流2h(表3)。2.3火木糖提取物的分離將標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液,火棘葉、果溶液,以含水量70%的微乳液-甲酸(94∶6)為展開劑(圖5)。由圖5可見,火棘黃酮能被微乳液薄層完全分離,火棘葉分離得到6個(gè)黃酮斑點(diǎn),火棘果分離得到5個(gè)黃酮斑點(diǎn)。在色譜圖中,火棘葉、果中各有1個(gè)黃酮成分的Rf值與蘆丁對(duì)照品相同;另外各有1個(gè)黃酮成分的Rf值與槲皮素對(duì)照品相同,表明火棘葉、果中均含有蘆丁、槲皮素。3火木糖提取物的分離根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果與分析,火棘中黃酮類化合物的最佳提取條件為:以70%的乙醇為溶劑,料液比為1∶8(W∶V),在80℃條件下回流提取2h。用十二烷基硫酸鈉-正丁醇-正庚烷-水按11.7∶15.6∶2.7∶70.0的比例組成的O/W型微乳液,