纖維素酶的檢測(cè)方法新

纖維素酶的檢測(cè)辦法摘要：本文重要介紹了纖維素酶的降解原理，通過(guò)實(shí)驗(yàn)比較了四種慣用纖維素酶的檢測(cè)辦法的穩(wěn)定性，以及纖維素酶的發(fā)展前景，為纖維素酶的應(yīng)用提供了進(jìn)一步的參考價(jià)值。核心詞：纖維素酶酶活測(cè)定葡萄糖回歸方程一、纖維素酶及其降解原理纖維素是高等植物細(xì)胞壁的重要成分，占植物總干重的30%-50%，是地球上分布最廣，含量最豐富的可再生性碳源化合物，占地球總生物量的40%。據(jù)報(bào)道，我國(guó)每年光作物秸稈，稻梗等含纖維素較豐富的物質(zhì)就有5億噸之多，全球每年通過(guò)光合作用產(chǎn)生的植物物質(zhì)高達(dá)1.55X109噸，其中尚有89%未被人們運(yùn)用，而大量的秸稈，稻梗等含纖維素豐富的物質(zhì)的運(yùn)用率也很低。大多采用燃燒的方式來(lái)解決，這樣就造成了環(huán)境污染，破壞了土壤的理化性質(zhì)和喪失了有機(jī)質(zhì)成分。因此，纖維素的充足運(yùn)用與有效的轉(zhuǎn)化對(duì)于解決現(xiàn)在的能源危機(jī)，糧食短缺，環(huán)境污染等有重大意義。纖維素酶是分解纖維素的一類(lèi)酶，它能將纖維素分解為葡萄糖，充足的運(yùn)用了纖維素。自19Sellieres在蝸牛消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來(lái)，纖維素酶的研究和應(yīng)用受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的極大關(guān)注，獲得了很大進(jìn)展?，F(xiàn)在，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)篩選產(chǎn)酶菌株來(lái)發(fā)酵產(chǎn)酶，再應(yīng)用纖維素酶到食品，醫(yī)藥，飼料，洗滌等工業(yè)中，不僅解決了纖維素的再運(yùn)用問(wèn)題還獲得了很可觀的經(jīng)濟(jì)效益。纖維素酶是由許多含有高協(xié)同作用的水解酶構(gòu)成的。習(xí)慣上將纖維素酶分成三種重要成分：內(nèi)切酶（內(nèi)切β-1,4-葡萄糖酶，也稱(chēng)Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也稱(chēng)C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即為纖維二糖酶）[1]。C1酶重要作用于天然纖維素，使之轉(zhuǎn)變?yōu)榉墙Y(jié)晶的纖維素。Cx酶又分為Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一種內(nèi)斷型纖維素酶，它從水合非結(jié)晶纖維素分子內(nèi)部作用于β-（1,4）糖苷鍵，生成纖維糊精和纖維二塘。Cx2酶是一種外斷型纖維素酶，它從水合性纖維素分子的非還原端作用于β-（1,4）糖背鍵，逐步切斷β-（1,4）糖節(jié)鍵生成葡萄糖。纖維二糖酶則作用于纖維二糖，生成葡萄糖。纖維素酶在降解纖維素過(guò)程中的作用機(jī)理至今還不是很清晰?，F(xiàn)在有關(guān)Cx酶、C1酶和β-1,4葡萄糖酶這3種酶的作用機(jī)理的假說(shuō)比較公認(rèn)的是下列3種，其中協(xié)同理論最為廣泛接受。（1）C1-Cx假說(shuō)。該理論認(rèn)為首先由C1酶作用于纖維素酶的結(jié)晶區(qū)，再由外切酶和β-葡萄糖苷酶聯(lián)合作用產(chǎn)生二糖和葡萄糖。其水解模式如圖1所示。圖1C1-Cx假說(shuō)示意（2）次序作用假說(shuō)。該假說(shuō)認(rèn)為首先由內(nèi)切酶隨機(jī)的作用于纖維素的葡萄糖苷鍵，打開(kāi)缺口，然后由外切酶在新生鍵末端切下一種纖維二糖，再由β-葡萄糖苷酶將它水解成葡萄糖。（3）協(xié)同作用假說(shuō)。該理論認(rèn)為是內(nèi)切葡萄糖酶首先攻打纖維素的非結(jié)晶區(qū)，形成外切纖維素酶需要的新的游離末端，然后外切纖維素酶從多糖鏈的非還原端切下纖維二糖單位，β-葡萄糖苷酶再水解纖維二糖單位形成葡萄糖。二、纖維素酶的檢測(cè)辦法纖維素酶各組分的底物專(zhuān)一性不同，并且纖維素酶是多組分復(fù)合物。纖維素酶作用的底物也比較復(fù)雜，同時(shí)不同來(lái)源的纖維素酶其構(gòu)成及各組分的比例有較大的差別，致使纖維素酶活力的測(cè)定辦法復(fù)雜而不統(tǒng)一。其中重要的檢測(cè)辦法有：棉線切斷法，濾紙崩潰法，羧甲基纖維素鈉為底物的粘度減少和還原糖增加的測(cè)定法[2]，分光光度計(jì)法[3]，快速測(cè)定纖維素酶CMC液化活力法[4]，平板法，巴魯阿-斯溫(Bamchandswain)測(cè)定法[5]。對(duì)于細(xì)菌等對(duì)纖維素分解能力強(qiáng)的微生物，由于對(duì)其酶的形成、分泌和作用機(jī)制研究較少，這些測(cè)定辦法不一定合用。但現(xiàn)在對(duì)于這些辦法測(cè)定的具體數(shù)值的可信度、可比性，卻沒(méi)有有關(guān)的報(bào)道研究。下面重要通過(guò)四種辦法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究這些實(shí)驗(yàn)辦法的穩(wěn)定性，從而為實(shí)驗(yàn)研究提供一定的參考根據(jù)[6]。2.1、材料與辦法材料：重要儀器HH-6型恒溫水浴鍋；22PC型分光光度計(jì)；HG1001型電熱鼓風(fēng)干燥箱；FA型電子分析天平；UV-2401型紫外雙光束分光光度計(jì)實(shí)驗(yàn)辦法：2.1.1試劑的配備：（1）PH4.6醋酸-醋酸鈉緩沖液：11.8ml冰醋酸定容至100ml，稱(chēng)取27,2g的醋酸鈉溶解并定容至100ml將上述兩種溶液等體積混合。（2）3,5-二硝基水楊酸溶液（DNS）：稱(chēng)取3,5-二硝基水楊酸6.3g于500ml大燒杯中，用少量蒸餾水溶解后加入2mol/mlNaOH溶液262ml，再加入到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g無(wú)水亞硫酸鈉攪拌溶解，冷卻后移入1000ml容量瓶中，用蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中，室溫放置一周后使用。（3）CMC-Na溶液：稱(chēng)取0.625g羧甲基纖維素鈉，加熱溶解，定容至100ml[7]。2.1.2酶活測(cè)定辦法葡萄糖原則曲線的繪制原理：3,5-二硝基水楊酸與還原糖共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范疇內(nèi)還原糖的量和反映液的強(qiáng)度成比例關(guān)系，運(yùn)用分光光度計(jì)測(cè)出其在520nm處的吸光度，得出還原糖的量。葡萄糖原則溶液的配制：將葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，稱(chēng)取0.1080g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100ml。取16支具塞試管，依次編號(hào)為0,1,2,3,4,5,6,7并作平行實(shí)驗(yàn)。由于多個(gè)辦法反映體系的總體積不同，因此需作不同的原則曲線，所加的量也有所不同?，F(xiàn)以總體積為9ml體系為例：表1葡萄糖原則曲線繪制辦法管號(hào)01234567葡萄糖量（ml）00.511.522.533.5蒸餾水（ml）76.565.554.543.5DNS(ml)22222222搖勻后置于沸水浴中加熱5min后，冷卻定容至25ml。搖勻后以0號(hào)管為對(duì)照于最大吸取波優(yōu)點(diǎn)測(cè)定OD值，以葡萄糖含量μmol為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制原則曲線。酶活測(cè)定辦法的比較配制不同濃度的原則酶液：用去離子水100ml來(lái)溶解100mg纖維素酶（≥1000IU），配制成1mg/ml酶液。測(cè)定時(shí)分別吸取0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml上述酶液用水補(bǔ)足至1ml即為不同濃度的酶液。（1）濾紙酶活（FPA）測(cè)定辦法濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居“中檔”的纖維性材料，以其為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量來(lái)表征纖維素酶系總的糖化能力的辦法，此辦法應(yīng)用廣泛，它反映了三類(lèi)酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱(chēng)濾紙酶活（FilterPaperActivity，F(xiàn)PA）辦法：取1ml酶液加1ml0.1mol/L、Ph4.6的醋酸緩沖液，預(yù)熱到50℃，加入1條1x6cm新華濾紙（50±1mg），50℃保溫1h。取出，沸水浴滅活5min，冷卻至室溫，用3mlDNS試劑顯色后稀釋3倍，測(cè)OD值（520nm）。OD值越大，闡明該菌株的酶活力越強(qiáng)[8]。酶活力計(jì)算：從原則曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；酶活力（μ/ml）=其中：60為保溫時(shí)間（酶與底物作用時(shí)間，min）；Ew為粗酶液的體積（ml）；μ是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量。（2）羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）酶活性測(cè)定辦法原理：纖維素酶對(duì)CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等還原糖，再用DNS法顯色，用原則葡萄糖溶液作原則液，22PC分光光度計(jì)在520nm處測(cè)其吸光度，以每分鐘生成相稱(chēng)于1μmol的葡萄糖為一種酶活性單位。取3支帶有20ml刻度的試管，1支管作空白對(duì)照，2支管作平行樣品管。每支樣品管中加1ml酶溶液，置于50℃水浴鍋中預(yù)熱2min，然后在3支試管中分別加入4ml已預(yù)熱至50℃的底物溶液，精確計(jì)時(shí)5min取出，每管立刻分別加入1ml2mol/L氫氧化鈉溶液和2mlDNS顯色液，搖勻后在對(duì)照管中再加入1ml酶液。將3支試管放入沸水浴中，5min后立刻取出，流水冷卻，用蒸餾水定容至20ml，于520nm處測(cè)OD值。酶活力計(jì)算：從原則曲線中查出葡萄糖μmol數(shù)；酶活力（μ/ml）=其中：5為保溫時(shí)間（酶與底物作用時(shí)間，min）；Ew為粗酶液的體積（ml）；μ是指在特定條件下，每分鐘催化纖維素水解成1μmol葡萄糖的酶量。（3）染色纖維素測(cè)定辦法[9]用考馬斯亮藍(lán)使濾紙染色酶解后在最大吸取波優(yōu)點(diǎn)測(cè)釋放的著色物的吸光值，代表酶活，以吸光度為縱坐標(biāo)，酶濃度為橫坐標(biāo)做曲線。在實(shí)際測(cè)定時(shí)，先運(yùn)用紫外雙光束分光光度計(jì)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)其在536nm處吸取峰最高，因此在實(shí)驗(yàn)時(shí)以此波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)。（4）CMC粘度減少測(cè)定辦法底物溶液9ml，加酶液1ml，40℃，測(cè)定底物粘度減至二分之一時(shí)所需時(shí)間，以?shī)W氏粘度計(jì)測(cè)定。以10min能使底物粘度減少二分之一的酶活作為一種單位。2.2成果與分析葡萄糖原則曲線繪制實(shí)驗(yàn)中所用的原則葡萄糖曲線繪制成果以下：由于在后來(lái)的測(cè)定中，各辦法的反映體系并不相似，因此每個(gè)體系須有各自的葡糖糖原則曲線作為此后的參考。CMC糖化力測(cè)定參考圖1，有三條曲線，是由于在慣用測(cè)定中酶與底物不同，而造成它們各自體系的溶液的總體積也不相似，因此此辦法的葡萄糖原則曲線有三條。濾紙法參考圖2。圖1CMC酶活測(cè)定法葡糖糖原則曲線(不同體系)所得三條曲線的回歸方程以下：y1=0.0292x-0.0101R12=0.9981y2=0.0211x-0.0107R22=0.9965y3=0.0163x-0.0074R32=0.9955圖2濾紙法葡糖糖原則曲線所得曲線的回歸方程：y=0.1418x-0.0141R2=0.998原則纖維素酶酶活曲線酶活測(cè)定辦法成果比較以下：表2原則纖維素的CMC酶活力和濾紙酶活力測(cè)定成果CMC酶活力測(cè)定法濾紙酶活力測(cè)定法（FPA）含酶量（mg/mL）OD值查得葡萄糖量（μmol）酶活（U/mL）OD值查得葡萄糖量（μmol）酶活（U/mL）00000000.20.1023.840.7680.0540.4800.0080.30.1465.351.0690.0900.7340.0120.40.2027.261.4530.1150.9100.0150.50.2589.181.8360.1481.1440.0190.60.29610.482.0970.1821.3800.023所得曲線的回歸方程:y=3.5908xR2=0.9973y=0.0383xR2=0.9985實(shí)驗(yàn)成果表明：用原則纖維素酶所做的CMC酶活測(cè)定和濾紙酶活測(cè)定，從回歸曲線能夠看出他們的線性較好，能夠充足闡明這2種辦法比較穩(wěn)定。并且CMC酶活測(cè)定法和濾紙酶活測(cè)定法在諸多報(bào)道中均在采用，這樣使實(shí)際實(shí)驗(yàn)的成果更具可比性。所得曲線的回歸方程：y=0.728x-0.029R2=0.8828所得曲線的回歸方程：y=0.0316x-0.0007R2=0.979由上述成果可知：CMC粘度減少法的線性沒(méi)有濾紙酶活測(cè)定法和CMC酶活測(cè)定法來(lái)得好，并且在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)之間有較大的誤差。但從回歸方程就能看出，該辦法的穩(wěn)定性較其它3種辦法有很大的偏差。表3原則纖維素的CMC粘度減少法和染色纖維素法測(cè)定成果CMC粘度減少法染色纖維素法含酶量（mg/mL）所用時(shí)間（min）酶活（U/mL）OD值酶量（mg）000000.277.40.1290.00480.20.360.60.1650.00930.30.445.30.2210.01070.40.537.50.2670.01440.50.620.00.5000.01950.62.3結(jié)論本次實(shí)驗(yàn)研究了纖維素酶測(cè)定辦法中慣用的4種辦法，即：FPA測(cè)定法、CMC-Na酶活性測(cè)定法、染色纖維素測(cè)定法以及CMC粘度減少測(cè)定法，比較了這4種辦法測(cè)定的線性有關(guān)性以及穩(wěn)定性，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究表明，F(xiàn)PA測(cè)定法和CMC-Na酶活性測(cè)定法較穩(wěn)定，線性有關(guān)性較高，能夠作為研究測(cè)定的可靠辦法。三、纖維素酶的應(yīng)用與發(fā)展趨勢(shì)纖維素酶可廣泛用于食品、紡織、飼料、釀酒、石油勘探、中藥成分提取等眾多領(lǐng)域，特別是在紡織、洗滌、造紙、和生物能源等工業(yè)應(yīng)用上含有重要地位。自20世紀(jì)90年代開(kāi)始，酸性纖維素酶用于牛仔布的水洗整頓(biostoningandbiofinishing)，從而開(kāi)始了纖維素酶在工業(yè)上的大規(guī)模應(yīng)用，這也是現(xiàn)在纖維素酶應(yīng)用最成功、用量最大的領(lǐng)域。在牛仔布的水洗整頓上酸性纖維素酶含有用量少、效果快的特點(diǎn)，但服裝返染嚴(yán)重；中性纖維素酶反映條件溫和并且不易返染，織物檔次得到提高，已普遍替代酸性酶。但在棉織物的整頓上，如去球(depilling)脫毛(reducedfuzz)以及增柔(softness)等，酸性纖維素酶特別是木霉產(chǎn)生的纖維素酶仍含有更多的優(yōu)勢(shì)。運(yùn)用纖維素酶對(duì)棉織物的整頓并不需要纖維素酶的全部組分，如進(jìn)行棉織物的脫毛、去球等整頓，僅有內(nèi)切酶就可產(chǎn)生明顯的效果，但是棉織物的減量也較嚴(yán)重，影響了織物的強(qiáng)度，通過(guò)基因工程變化內(nèi)切酶和外切酶的比例，能夠在一定程度上解決這個(gè)問(wèn)題。纖維素酶用于造紙工業(yè)，是運(yùn)用外切纖維素酶只從末端切斷纖維素的作用原理，提高紙張的光潔度。堿性纖維素酶用于洗滌劑工業(yè)，能夠提高棉織物的洗凈度，起重要作用的是內(nèi)切酶(CMC酶)，是近些年來(lái)洗滌劑工業(yè)競(jìng)相開(kāi)發(fā)的新酶種之一。這兩種工業(yè)應(yīng)用涉及的纖維素酶只需要纖維素酶系中的單一組分，基因工程技術(shù)能夠在其中得到廣泛的應(yīng)用。纖維素酶將來(lái)最大的用途，或者能夠使其產(chǎn)量得到巨大增加的工業(yè)需求將是纖維素乙醇的開(kāi)發(fā)。自上世紀(jì)70年代石油危機(jī)以來(lái)，世界各國(guó)都致力于開(kāi)發(fā)新的可再生能源，而生物乙醇(bioeth-anol)是被普遍看好的新型燃料。進(jìn)入21世紀(jì)，運(yùn)用纖維素酶轉(zhuǎn)化纖維素物質(zhì)產(chǎn)生葡萄糖進(jìn)而發(fā)酵獲得生物乙醇，能夠避免對(duì)糧食作物的大量損耗，引發(fā)了各國(guó)政府和研究機(jī)構(gòu)的重視，這其中的核心是纖維素酶的成本問(wèn)題。由于纖維素酶發(fā)酵活力較低，因此其應(yīng)用成本也較高。同時(shí)纖維素酶相比其它糖苷水解酶類(lèi)，比活力最少要低1~2個(gè)數(shù)量級(jí)，如濾紙酶的比活力為1IU/mg左右，CMC的比活力約為10IU/mg，從而造成酶的作用效率較低。這是兩個(gè)限制纖維素酶應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題，也是纖維素酶研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)?，F(xiàn)在通過(guò)傳統(tǒng)的菌種誘變和基因工程技術(shù)能夠較大幅度地提高目的蛋白的體現(xiàn)量，從而提高酶的發(fā)酵水平，如諾維信公司與美國(guó)能源部合作，將制造纖維素乙醇中的酶制劑成本由的每加侖5美元減少到的30美分，又減少到每加侖18美分。還能夠通過(guò)改善發(fā)酵條件和工藝，如采用固體發(fā)酵來(lái)大幅度減少發(fā)酵成本。但是提高酶降解天然纖維素的效率則需要，進(jìn)一步研究纖維素酶