活體成像發(fā)光技術(shù)1

活體成像發(fā)光技術(shù)基本原理活體動物成像技術(shù)的基本原理是透過體表,接收動物體內(nèi)物質(zhì)所發(fā)出的熒光或可見光顯像,因此檢測中需要對病灶部位(或藥物)進(jìn)行造影標(biāo)記。分類可見光成像

(opticalimaging)核素成像（radio-nuclearimaging）核磁共振（magneticresonanceimaging，MRI）成像超聲（ultrasound）成像計(jì)算機(jī)斷層攝影（computedtomography，CT）成像

1.生物發(fā)光（bioluminescence）-用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA

2.熒光染料標(biāo)記（fluorescence）-用熒光報告基團(tuán)（GFP、RFP,Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記生物發(fā)光（bioluminescence）的基本原理哺乳動物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶與其小分子底物熒光素在氧、Mg2+存在的條件下消耗ATP發(fā)生氧化還原反應(yīng),將部分化學(xué)能轉(zhuǎn)化為可見光能釋放。因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)步驟

細(xì)胞標(biāo)記或動物標(biāo)記進(jìn)行生物發(fā)光實(shí)驗(yàn)，首先根據(jù)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同，用熒光素酶基因標(biāo)記腫瘤細(xì)胞、干細(xì)胞、病毒、藥物載體或動物，或者用Lux操縱子標(biāo)記細(xì)菌。用熒光素酶基因標(biāo)記可通過質(zhì)粒、慢病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒等方法進(jìn)行。體外預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測需要檢測的細(xì)胞、病毒、細(xì)菌等標(biāo)記后，在活體成像前，可以通過多孔板預(yù)先檢測一下標(biāo)記是否成功，熒光素酶或熒光蛋白的表達(dá)強(qiáng)度等，并據(jù)此篩選陽性克隆、繪制標(biāo)記物的發(fā)光梯度曲線等。體外預(yù)實(shí)驗(yàn)是作為小動物活體成像解決方案中不可缺少的一部分。比如，利用體外預(yù)實(shí)驗(yàn)初步檢測轉(zhuǎn)染熒光素酶的腫瘤細(xì)胞發(fā)光值，選擇轉(zhuǎn)染率相對高且穩(wěn)定的一批細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。對于通常進(jìn)行的細(xì)胞檢測來說，具體可以通過活體成像儀器檢測活細(xì)胞的發(fā)光強(qiáng)度，也可以通過體外化學(xué)發(fā)光和熒光檢測儀檢測細(xì)胞裂解液的發(fā)光強(qiáng)度。當(dāng)用體外化學(xué)發(fā)光和熒光檢測儀時，可以更準(zhǔn)確地捕捉到發(fā)光值、更穩(wěn)定的輸出發(fā)光值。（微孔板式化學(xué)發(fā)光檢測儀，如BertholdCentroLB960）活體成像麻醉實(shí)驗(yàn)動物注射底物熒光素。最佳的檢測時間是在注射后15到35分鐘之間。(對于不同的動物模型，發(fā)光動力學(xué)過程并不完全一致，最好先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定何時發(fā)光信號最強(qiáng)。)成像，檢測時間一般是1分鐘到5分鐘，如果信號特別弱，也可以延長到10分鐘，如果信號特別強(qiáng)，也可在1分鐘以內(nèi)。對于熒光來說，檢測時間是1秒以內(nèi)。為節(jié)約時間，檢測生物發(fā)光，最多可同時檢測5只小鼠。生物發(fā)光及熒光特點(diǎn)的比較

優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)生物發(fā)光1.高靈敏度（105vs102）2.檢測深度高3.可進(jìn)行經(jīng)確定量4.特異性強(qiáng)，無需激發(fā)光；

對環(huán)境變化反應(yīng)迅速，圖像清楚；信噪比較低信號較弱，成像速度慢，需要注入熒光素，儀器精密度要求高有些物質(zhì)不能用生物發(fā)光標(biāo)記，如抗體、多肽等很難用于人體熒光多種蛋白及染料可用于多重標(biāo)記，標(biāo)記相對簡單，無需底物，價廉活體動物、動物尸體、器官全部可以進(jìn)行成像非特異性熒光限制了靈敏度

信噪比高不能精確定量

高靈敏度——生物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，也會發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度。特別是當(dāng)發(fā)光細(xì)胞深藏于組織內(nèi)部，則需要較高能量的激發(fā)光源，也就會產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音。熒光成像的靈敏度最高也只能在動物體內(nèi)檢測到約105細(xì)胞，相對于生物發(fā)光在動物體內(nèi)監(jiān)測到102數(shù)量級細(xì)胞的靈敏度要相差很多。檢測的深度由于生物發(fā)光的靈敏度高于熒光成像，對于需要深部成像的研究（檢測的深度在3~4cm），如干細(xì)胞、原位腫瘤與轉(zhuǎn)移，自發(fā)腫瘤等，應(yīng)用生物發(fā)光成像是最佳的選擇。生物發(fā)光信號可以用于精確定量，

因?yàn)闊晒馑孛富蚴遣迦爰?xì)胞染色體中穩(wěn)定表達(dá)的，單位細(xì)胞的發(fā)光數(shù)量很穩(wěn)定。即便標(biāo)記細(xì)胞在動物體內(nèi)有復(fù)雜的定位，亦可從動物體表的信號水平直接得出發(fā)光細(xì)胞的相對數(shù)量。而對于熒光，激發(fā)光需要穿過組織到達(dá)靶點(diǎn)，發(fā)射光需要從體內(nèi)出來，路徑較長。信號水平取決于激發(fā)光的強(qiáng)度、發(fā)光細(xì)胞的數(shù)量、靶點(diǎn)的深度、光線穿過的組織對其的吸收及散射等因素，使得熒光強(qiáng)度較難定量。特異性強(qiáng)，無自發(fā)熒光生物發(fā)光方法是以酶和底物的特異作用而發(fā)光，特異性極強(qiáng)。動物本身沒有任何自發(fā)光，使得生物發(fā)光具有極低的背景，極高的信噪比。但用熒光方法時，在受到激發(fā)光激發(fā)時，生物體中皮膚、毛發(fā)和各種組織及食物等都會產(chǎn)生熒光，特別是被標(biāo)記的靶點(diǎn)深臧于組織內(nèi)部，需要較高能量的激發(fā)光時，也就會產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音。雖然熒光信號強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過生物發(fā)光，但極低的自發(fā)光水平使得生物發(fā)光的信噪比遠(yuǎn)高于熒光。生物發(fā)光與其他體內(nèi)成像技術(shù)的比較優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)生物發(fā)光適用于小動物的研究，靈敏度高，特異性好，操作簡單，無放射性無法標(biāo)記小分子藥物，暫不適用于人類和臨床(正在研究中)，其他體內(nèi)成像技術(shù)（PET,CT,MRI）分辨率高，不需標(biāo)記適用于小分子藥物標(biāo)記特異性差，在腫瘤很小時無法區(qū)分腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞，并且對于腫瘤細(xì)胞的活躍程度不敏感小動物CT需要對動物有較強(qiáng)的X-射線照射，容易引起突變，對動物的生理有一定影響技術(shù)應(yīng)用1.腫瘤學(xué)活體生物發(fā)光成像技術(shù)能夠讓研究人員能夠直接快速的測量各種癌癥模型中腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移以及對藥物的反應(yīng)。其特點(diǎn)是

極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個細(xì)胞）也可以被檢測到，比傳統(tǒng)方法的靈敏度大大提高了；

非常適合于腫瘤體內(nèi)生長的定量分析；

避免由于宰殺老鼠而造成的組間差異；節(jié)省動物成本。

由于以上特點(diǎn)，使基于轉(zhuǎn)移模型、原位模型、自發(fā)腫瘤模型等方面的腫瘤學(xué)研究得到發(fā)展。建立腫瘤轉(zhuǎn)移模型，可以觀察腫瘤轉(zhuǎn)移情況，進(jìn)一步探討腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制；可進(jìn)行原位接種，觀察原位以及原位轉(zhuǎn)移模型，使腫瘤學(xué)研究更接近腫瘤臨床發(fā)病的微觀環(huán)境；通過建立自發(fā)腫瘤模型，可以觀察腫瘤發(fā)生機(jī)理2.藥物研究

在藥效學(xué)評價方面，熒光素酶癌癥模型可用于癌癥體內(nèi)用藥在整體動物水平上進(jìn)行長期療效跟蹤觀察。利用無創(chuàng)傷活體成像對癌細(xì)胞生長的檢測，可對癌癥治療之前和過程中的癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時觀測和評估。這種方式提供一個很好的對癌細(xì)胞的反應(yīng)和復(fù)發(fā)評估的預(yù)診斷途徑。用活體成像的方法比傳統(tǒng)技術(shù)有更高的靈敏度，當(dāng)用傳統(tǒng)的方法還不能檢測到瘤塊時，用該技術(shù)已經(jīng)可以檢測到很強(qiáng)的信號。由于該技術(shù)只是檢測活細(xì)胞，不能檢測已經(jīng)凋亡的細(xì)胞。而用傳統(tǒng)的方法，不能區(qū)別正常細(xì)胞與凋亡的細(xì)胞，所以該技術(shù)可以比傳統(tǒng)技術(shù)更早更靈敏的發(fā)現(xiàn)藥物的療效。

利用活體成像技術(shù)高靈敏度、觀察方便的特點(diǎn)，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過給予腫瘤接種的小鼠不同劑量，不同給藥時間、不同給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量及給藥時間，從而制定合適的劑型與服藥時間。

在藥物代謝方面，標(biāo)記與藥物代謝有關(guān)的基因，比如CYP3A4等，研究不同的藥物對該基因表達(dá)的影響，從而可以間接知道相關(guān)藥物在體內(nèi)代謝的情況。

在藥劑學(xué)研究方面，可以