實驗設計卵清蛋白

雞蛋清中卵清蛋白的提取及其活性測定生命科學學院生化實驗操作大賽1精品課件Contents實驗目的實驗原理實驗方法實驗材料及用品實驗本卷須知實驗步驟2精品課件實驗目的1.掌握提取雞蛋清中卵清蛋白的根本原理和方法。2.掌握紫外分光光度計的使用方法及本卷須知。3.掌握用紫外吸收法測定蛋白質活性，了解其他測定蛋白質活性的方法。3精品課件實驗原理一、沉淀法粗別離蛋白質沉淀法是別離純化生物大分子物質常用的一種經(jīng)典方法，可分鹽析法、等電點沉淀法和有機溶劑沉淀法等。蛋白質分子外表含有帶電荷基團，這些基團與水分子有較大的親和力，故蛋白質在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白質水溶液的穩(wěn)定性。如果在蛋白質溶液中參加大量中性鹽，導致蛋白質分子外表電荷被中和，水化膜被破壞，最終引起蛋白質分子間相互聚集并從溶液中析出，這就是鹽析作用。由于各種蛋白質分子外表的極性基團所帶電荷數(shù)目不同，它們在蛋白質外表上的分布情況也不一樣，因此，將不同蛋白質鹽析出來所需要的鹽濃度也各異，鹽析法就是通過控制鹽的濃度，使蛋白質混合液中的各個成分分步鹽析出來，到達粗別離蛋白質的目的。4精品課件實驗原理雞蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白〔卵清蛋白〕，球蛋白可在半飽和硫酸銨溶液中析出，而卵清蛋白那么在飽和硫酸銨溶液中才能析出。蛋白質的鹽析作用是可逆過程，由鹽析獲得的蛋白質沉淀，當降低其鹽類濃度時，又能再溶解，因而可初步純化蛋白質。等電點沉淀法是利用蛋白質在其等電點時溶解度最小來別離具有不同等電點蛋白質的方法。蛋白質是兩性電解質，蛋白質分子的電荷性質和數(shù)量因PH不同而變化，蛋白質處于等電點時，其凈電荷為零，由于相鄰蛋白質分子之間沒有靜電斥力而趨于聚集沉淀，因此，在其他條件相同時，它的溶解度到達最低點。卵清蛋白的等電點為4.6-4.8，而球蛋白的等電點是5.1。5精品課件蛋清中各種蛋白的理化性質名稱比例分子量KDa等電點卵清蛋白52%454.5伴清蛋白13%786.6溶菌酶11%284.0-4.3卵類粘蛋白3.5%1410.7卵粘蛋白1.5%18(α)400(β)4.7免疫球蛋白<1.0%不同不同6精品課件實驗原理二、蛋白質的活性測定根據(jù)蛋白質的物理化學性質，測定蛋白質的方法有凱氏定氮法、紫外吸收法、Folin-酚法、考馬斯亮藍G-250染色法等。由于蛋白質分子中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此蛋白質具有吸收紫外線的性質，吸收頂峰在280nm波長處。在此波長范圍內，蛋白質溶液的光吸收值〔A280〕與其含量呈正比關系，可用作定量測定。由于核酸在280波長處也有光吸收，對蛋白質的測定有干擾作用，但核酸的最大吸收峰在260nm處，如同時測定260nm的光吸收，通過計算可能消除其對蛋白質測定的影響，因此溶液中存在核酸時必須同時測定280nm及260nm的光密度，方可通過計算測得溶液中的蛋白質濃度。7精品課件實驗方法一.蛋白質提取鹽析+等電點沉淀法可用作鹽析的中性鹽有過硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉、硫酸銨等。其中應用最廣的是硫酸銨，硫酸銨在水中溶解度大，25℃可達4.1mol/L的濃度，化學性質穩(wěn)定，溶解度的溫度系數(shù)變化較小，價廉易得；分段效果較其他鹽好，性質溫和，即使?jié)舛群芨邥r也不會影響蛋白質的生物學活性。等電點沉淀法是利用蛋白質在其等電點時溶解度最小來別離具有不同等電點蛋白質的方法。其他方法〔一〕根據(jù)蛋白質溶解度不同的別離方法：低溫有機溶劑沉淀法〔二〕根據(jù)蛋白質分子大小的差異的別離方法：透析與超濾、凝膠過濾法〔三〕根據(jù)蛋白質帶電性質進行別離：電泳法、離子交換層析法8精品課件實驗方法二.蛋白質活性測定

紫外吸收法

紫外線吸收法測定蛋白質含量的優(yōu)點是迅速、簡便、不消耗樣品，低濃度鹽類不干擾測定。

其他方法

凱氏定氮法，雙縮尿法、Folin－酚試劑法、考馬斯亮藍法9精品課件實驗材料及用品1、材料：

新鮮雞蛋2、試劑：

飽和硫酸銨、硫酸銨結晶、生理鹽水、1mg/mL標準牛血清白蛋白液3、器具：紫外分光光度計、離心機、恒溫水浴鍋、冰箱、電子天平10精品課件實驗步驟一.卵清蛋白的提取11精品課件實驗步驟二.卵清蛋白活性測定：〔一〕紫外吸收法測定卵清蛋白的含量1、標準曲線法〔1〕標準曲線的繪制按下表分別向每支試管參加各種試劑，搖勻。在280nm波長處分別測定各管溶液的A280值。以A280值為縱坐標，蛋白質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。試管號試劑123456789提取液標準蛋白溶液/mL00.51.01.52.02.53.04.01.0蒸餾水/mL4.03.53.02.52.01.51.003.0蛋白質濃度/mg/mL00.1250.250.3750.500.6250.751.0A28012精品課件實驗步驟〔二〕蛋白提取液中蛋白質含量測定1、提取液分別稀釋1倍、10倍、20倍后，取待測蛋白質溶液1ml，參加蒸餾水3ml，搖勻，按上述方法在280nm波長處測定光吸收值，并從標準曲線上查出經(jīng)稀釋的待測蛋白質的濃度。排除干擾：將待測蛋白質溶液適當稀釋，在波長260nm和280nm處分別測出A值，然后利用280nm及260nm下的吸收差求出蛋白質濃度。2.計算：蛋白質濃度〔mg/ml〕=1.45A280-0.74A260〔式中A280和A260分別是該溶液在280nm和260nm波長下測得的光吸收值〕13精品課件實驗本卷須知1

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蛋白質提取過程中須注意溫度的控制，一般在20℃

以下進行調節(jié)等電點一定要準確，在本實驗中，球蛋白和卵