木質(zhì)纖維素降解酶預(yù)處理研究進(jìn)展

木質(zhì)纖維素降解酶預(yù)處理研究進(jìn)展

制備纖維素酶解的關(guān)鍵底物特性從木材和纖維中合成能源和生物材料，逐步建立生物精煉經(jīng)濟(jì)模式，與原油精煉相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)生物精煉與原油精煉的一體化。這是促進(jìn)中國能源和資源開發(fā)的有效對(duì)策。在木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化過程中,基于糖平臺(tái)的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)由于反應(yīng)條件溫和、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)備受青睞。然而,如何高效水解纖維類復(fù)雜多糖仍制約著木質(zhì)纖維素生物精煉的發(fā)展。木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜、性質(zhì)穩(wěn)定,很難被酶或微生物降解。在過去幾十年,人們?cè)谌绾翁岣吣举|(zhì)纖維素酶解效率以及明確纖維素酶解制約因素方面做了大量的研究(圖1)。一方面,在工藝上開發(fā)了大量木質(zhì)纖維素預(yù)處理技術(shù)(包括常規(guī)預(yù)處理與新型預(yù)處理),旨在破壞木質(zhì)纖維素的頑抗特性,提高酶解效率;另一方面,在機(jī)理上剖析制約纖維素酶解的頑抗特性(包括木質(zhì)素、半纖維素等化學(xué)特性;酶可及度、結(jié)晶度、氫鍵等物理特性),旨在明確關(guān)鍵底物特性,反饋指導(dǎo)新型預(yù)處理技術(shù)開發(fā)。由于木質(zhì)纖維素的頑抗特性以及纖維素仍存在酶水解效率低、纖維素酶價(jià)格昂貴等不足,因此,木質(zhì)纖維素預(yù)處理是提高其酶解糖化效率、降低酶使用成本的必要環(huán)節(jié),也是目前制約木質(zhì)纖維素生物煉制的技術(shù)瓶頸之一。研究表明纖維素酶解效率的高低很大程度上取決于木質(zhì)纖維素的預(yù)處理效果,即底物各種物化特性的改變情況。美國能源部在纖維素乙醇發(fā)展計(jì)劃中將預(yù)處理方式篩選以及關(guān)鍵底物特性確定列為未來5~10年重要研究課題。通過前人的研究,可以清晰理解制約纖維素酶解的關(guān)鍵因素,進(jìn)而指導(dǎo)預(yù)處理方式篩選評(píng)價(jià)與新型預(yù)處理技術(shù)開發(fā)。本文綜述了近幾年(2008~2011年)來國內(nèi)外在木質(zhì)纖維素預(yù)處理技術(shù)以及底物頑抗特性方面取得的最新研究進(jìn)展(圖1),并對(duì)這些底物特性在不同的預(yù)處理過程中的變化以及如何影響木質(zhì)纖維的酶解效率進(jìn)行了詳細(xì)分析和評(píng)述。1纖維素與半纖維和木質(zhì)素木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。其中,纖維素是由D-葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵聯(lián)結(jié)而成的長鏈分子,長鏈分子進(jìn)一步通過氫鍵等作用力形成具有高度結(jié)晶區(qū)的超分子穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。同時(shí)纖維素周圍緊密鑲嵌著半纖維和木質(zhì)素,這種復(fù)雜而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)使得纖維素很難被酶水解。為提高纖維素酶解效率,必須對(duì)木質(zhì)纖維素原料進(jìn)行預(yù)處理。如何通過預(yù)處理破壞木質(zhì)纖維素的頑抗結(jié)構(gòu),提高纖維素酶解效率受到了國內(nèi)外普遍關(guān)注。木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法眾多,包括常規(guī)預(yù)處理及近幾年報(bào)道的新型預(yù)處理技術(shù),這些技術(shù)在預(yù)處理效果、成本、可操作性、通用性以及規(guī)?；瘧?yīng)用方面各有優(yōu)缺點(diǎn)。由于國內(nèi)外有關(guān)常規(guī)預(yù)處理技術(shù)的綜述較多,本文只作簡單匯總,將重點(diǎn)介紹近幾年報(bào)道的新型預(yù)處理技術(shù),并對(duì)新技術(shù)的預(yù)處理效果及其優(yōu)勢(shì)進(jìn)行分析和評(píng)述。1.1半纖維素酶解處理常見的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法有球磨法、稀硫酸法、氨水預(yù)處理、石灰預(yù)處理、熱水預(yù)處理、蒸汽爆破法以及生物預(yù)處理方法等(表1)。其中,機(jī)械球磨法對(duì)化學(xué)組成基本沒有影響,但可以有效減小顆粒尺寸以及降低木質(zhì)纖維素結(jié)晶度和聚合度,從而促進(jìn)木質(zhì)纖維素的酶降解,但處理過程能耗較大,且對(duì)木質(zhì)素含量較高的原料預(yù)處理效果不明顯。稀硫酸處理主要通過水解半纖維素,破壞半纖維素-木質(zhì)素之間的化學(xué)鍵,達(dá)到增大酶可及表面積的效果,同時(shí)還可減小纖維素的平均聚合度,酸預(yù)處理方法對(duì)木質(zhì)素脫除以及結(jié)晶度破壞效果不明顯,并且容易產(chǎn)生微生物發(fā)酵抑制物,增加了后續(xù)處理的難度,此外,稀酸對(duì)預(yù)處理裝置的腐蝕性也是制約其工業(yè)化的重要因素之一。堿預(yù)處理方法,如氨水浸泡處理、循環(huán)氨水處理、石灰預(yù)處理等,處理?xiàng)l件較溫和,不易產(chǎn)生抑制物,在一定條件下可有效脫除木質(zhì)素,并伴有少量半纖維素發(fā)生水解,可及內(nèi)表面積增加。堿處理難以破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)晶度,與無定形纖維素相比,其酶解時(shí)間仍較長,此外,大部分半纖維素殘留在固體組分,后續(xù)酶解產(chǎn)生的混合糖需要分離或綜合利用。蒸汽爆破法與氨氣爆破法使纖維素發(fā)生機(jī)械斷裂的同時(shí)破壞纖維素內(nèi)部的氫鍵,亦可有效去除半纖維素和部分木質(zhì)素并破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)。蒸汽爆破法對(duì)設(shè)備要求較高,設(shè)備投入大,制約了規(guī)?；瘧?yīng)用。生物法則主要采用白腐真菌或木質(zhì)素降解酶等降解原料中的木質(zhì)素,提高纖維素的酶解效率。生物法處理?xiàng)l件最為溫和,且過程綠色,但預(yù)處理時(shí)間過長,目前還難以與化學(xué)處理法相媲美。1.2改性木質(zhì)素預(yù)處理近幾年來,國內(nèi)外報(bào)道了一些新型的預(yù)處理方法(表1),例如:化學(xué)組合預(yù)處理(如酸堿耦合預(yù)處理、纖維素溶劑/有機(jī)溶劑預(yù)處理)、物理-化學(xué)組合預(yù)處理(如微波輔助離子液體、微波輔助化學(xué)預(yù)處理、乙醇蒸煮-球磨法)、物理/化學(xué)-生物組合預(yù)處理、低溫預(yù)處理、綠色溶劑法、電化學(xué)預(yù)處理等。其中,組合預(yù)處理綜合了單個(gè)預(yù)處理方法的優(yōu)點(diǎn),因此在預(yù)處理效果上更為顯著。此外,一些新型的綠色溶劑,包括N-甲基氧化嗎啉(N-methyl-morpholineN-oxide,NMO)、新型離子液體等,對(duì)木質(zhì)纖維素預(yù)處理效果也表現(xiàn)出獨(dú)有的優(yōu)勢(shì),但目前尚在實(shí)驗(yàn)室階段,規(guī)?；糯蠛吞幚沓杀旧嫌写M(jìn)一步探索。最近,電化學(xué)處理法也用于脫除木質(zhì)素,以提高木質(zhì)纖維素的酶解效率。整體而言,新型預(yù)處理方法在很多方面相比常規(guī)方法更具優(yōu)勢(shì),在工業(yè)化應(yīng)用方面也更具可行性。1.2.1纖維素底物及酶解滌綸本課題組提出了木質(zhì)纖維素酸堿組合預(yù)處理工藝,該工藝采用弱酸-弱堿(甲酸-氨水)或強(qiáng)酸-強(qiáng)堿(稀硫酸-氫氧化鈉)兩步處理木質(zhì)纖維素原料,脫除了大部分半纖維素和木質(zhì)素,獲得高纖維素含量的底物。木質(zhì)纖維素經(jīng)酸處理后,由于保留了大部分木質(zhì)素,使得后續(xù)酶降解效果并不理想。而酸堿兩步處理后,非纖維素類物質(zhì)基本脫除,酸處理產(chǎn)生的抑制物也得以大幅度減小,其纖維素酶解率顯著提高。甲酸處理雖然亦可有效分離木質(zhì)纖維素三大組分,但有可能引起纖維素聚集,從而大大減小了酶可及表面積,酶解效果不明顯。經(jīng)過后續(xù)氨水浸泡處理,在溫和條件下,即可顯著增大底物的酶可及表面積,纖維素水解率從35%提高到85%。特別地,經(jīng)過酸堿組合預(yù)處理的底物,由于密度高,非纖維素類物質(zhì)少,非常適合后續(xù)高固反應(yīng)(在相同條件下黏度低),研究表明固液比(質(zhì)量/體積)可從常規(guī)的5%~7.5%提高到19%,通過分批補(bǔ)料策略可進(jìn)一步提高到25%。高纖維素含量底物在高固液比條件下酶解發(fā)酵,可獲得高濃度的燃料乙醇,進(jìn)而降低后續(xù)乙醇蒸餾成本。Zhang等提出了纖維素溶劑-有機(jī)溶劑組合預(yù)處理方法。該方法采用濃磷酸作為纖維素溶劑,丙酮作為有機(jī)溶劑,在溫和(常壓,50℃)條件下處理木質(zhì)纖維素原料。高濃磷酸(>83%)顯著破壞了木質(zhì)纖維素的結(jié)晶度,后續(xù)的丙酮處理和水洗過程分別去除了木質(zhì)素和水溶性半纖維素水解糖,經(jīng)處理得到的無定形的纖維素底物,在4h內(nèi)即可達(dá)到80%以上的水解率。最近,該研究小組還報(bào)道了一種改進(jìn)的纖維素溶劑-有機(jī)溶劑組合預(yù)處理方法,即利用乙醇代替丙酮作為有機(jī)溶劑。與丙酮相比,乙醇成本低、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,無毒,且回收要求低(可在發(fā)酵后繼續(xù)回收)。雖然乙醇脫除木質(zhì)素能力有限,但是該方法在去結(jié)晶度和脫除半纖維素方面依然顯著,即使在超低酶用量[1FPU·(gglucan)-1]情況下仍可達(dá)到非常理想的水解效果(>88%)。纖維素溶劑-有機(jī)溶劑組合預(yù)處理方法最顯著的優(yōu)勢(shì)在于破壞了木質(zhì)纖維素的結(jié)晶度,獲得了無定形的底物,與常規(guī)方法相比,后續(xù)酶用量大幅度減少,酶解時(shí)間大為縮短,是一種極具潛力的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法。1.2.2微波輔助的組合預(yù)處理工藝目前,已報(bào)道的物理-化學(xué)組合預(yù)處理方法主要有乙醇蒸煮-球磨法、加壓熱水-球磨法、微波-離子液體預(yù)處理等。其中,在乙醇蒸煮-球磨法處理過程中,木質(zhì)纖維素經(jīng)乙醇蒸煮后,更適用于后續(xù)的球磨處理,兩步處理后底物顆粒尺寸減小,結(jié)晶度也發(fā)生了破壞。相比常規(guī)的硫酸-乙醇蒸煮預(yù)處理工藝,本工藝避免了硫酸的使用,以及隨之產(chǎn)生的單糖降解、設(shè)備腐蝕、抑制物脫除等問題;在加壓熱水-球磨法組合處理過程中,半纖維素在加壓熱水中發(fā)生部分水解,破壞了木質(zhì)纖維素的完整性,可減少后續(xù)球磨時(shí)間,降低預(yù)處理能耗。與單獨(dú)高壓熱水預(yù)處理相比,該工藝還可以顯著減少酶用量(從每克底物40FPU減少到4FPU),因此更具經(jīng)濟(jì)可行性。除了球磨法處理外,微波也是一種常見的物理處理方式。基于微波協(xié)助的組合預(yù)處理工藝也已見報(bào)道。其中,在微波-離子液體預(yù)處理體系中,微波顯著加強(qiáng)了纖維素在離子液體中的溶解性,同時(shí)也減小了纖維素的聚合度。此外,微波-酸處理、微波-堿處理等組合預(yù)處理工藝也均表明微波處理有助于提高纖維素的酶解效率。1.2.3預(yù)處理+p.ostrorachio目前生物預(yù)處理主要存在預(yù)處理周期長、效率低等問題。為此,Yu等報(bào)道了一種物理/化學(xué)-生物組合預(yù)處理工藝,利用超聲或雙氧水(H2O2)溫和預(yù)處理后再用P.ostreatus微生物脫除木質(zhì)素。超聲或H2O2處理后木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)發(fā)生了破壞,有助于微生物進(jìn)入內(nèi)部,提高了木質(zhì)素脫除效率。相比單獨(dú)微生物預(yù)處理,組合預(yù)處理大幅度減少了反應(yīng)時(shí)間,也減小了糖組分的損失,因此更具可行性。1.2.4溫度-15法目前大部分的木質(zhì)纖維素預(yù)處理在常溫或高溫條件下進(jìn)行。文獻(xiàn)[42-45]報(bào)道了一種新型的低溫預(yù)處理方式,如NaOH-尿素低溫預(yù)處理。該方法基于纖維素在低溫(-15℃)NaOH溶液中的溶解特性,可破壞木質(zhì)纖維素的頑抗結(jié)構(gòu),增大木質(zhì)纖維素顆粒的松散度。此外,低溫條件下溶液凝固過程中體積膨脹,也有助于破壞纖維素內(nèi)部結(jié)構(gòu),增大酶可及表面積。在7%NaOH-12%尿素處理?xiàng)l件下,相比中溫預(yù)處理(60℃),纖維素轉(zhuǎn)化率提高了兩倍。由于低溫處理?xiàng)l件特殊,在寒冷地帶或冬季,可在室外直接預(yù)處理,不需額外耗能,是一種很有應(yīng)用價(jià)值的預(yù)處理方式。1.2.5nmo預(yù)處理N-甲基氧化嗎啉(NMO)是一種工業(yè)纖維素溶劑,最近有報(bào)道用于處理高結(jié)晶度的木質(zhì)纖維素。隨著NMO溶劑濃度的下降,NMO與木質(zhì)纖維素作用模式從溶解(NMO濃度85%)、膨脹(79%)到溶脹(73%)變化。其中,高濃度NMO下溶解模式是最有效的預(yù)處理方法,該條件下完全打破了纖維素鏈之間的氫鍵和減弱范德華力,使得纖維素結(jié)晶度顯著降低。NMO預(yù)處理效果明顯、處理?xiàng)l件相對(duì)溫和,且NMO具有安全無毒、可生物降解、易回收等優(yōu)點(diǎn),有望成為一種有潛力的木質(zhì)纖維素預(yù)處理方法。離子液體應(yīng)用于溶解再生纖維素預(yù)處理早有報(bào)道,例如[Amim][Cl]、[Bmim][Cl]離子液體。近年來,報(bào)道了一些新型離子液體用于處理木質(zhì)纖維素,其中,[Emim][CH3COO]是一種選擇性溶解木質(zhì)素的離子液體,纖維素在該溶劑中難以溶解,但結(jié)晶度發(fā)生了明顯的破壞,尤其是當(dāng)木質(zhì)素脫除40%后。木質(zhì)素的脫除以及纖維素結(jié)晶度的下降,使得底物酶解效率達(dá)90%以上。目前,離子液體雖然可回收再利用,但與常規(guī)預(yù)處理方法相比,其成本仍然較高,因此,新型離子液體的設(shè)計(jì)、低成本合成與回收還需大量研究,為木質(zhì)纖維素高值轉(zhuǎn)化利用提供預(yù)處理試劑。1.2.6木質(zhì)素的應(yīng)用最近,制漿工藝中用于漂白的電化學(xué)處理過程引起了預(yù)處理研究者的興趣。在最初的制漿漂白工藝中,利用電化學(xué)作用去除具有顏色的木質(zhì)素,保留了維持紙張機(jī)械強(qiáng)度的纖維素和半纖維素。由于該方法具有很好的去除木質(zhì)素效果,所以被嘗試應(yīng)用于木質(zhì)纖維素的預(yù)處理。電化學(xué)處理過程中,通過電解NaCl得到富含HClO的電化學(xué)活化水,進(jìn)而對(duì)木質(zhì)纖維素發(fā)生作用。實(shí)驗(yàn)證明該過程可有效脫除木質(zhì)素,提高酶解效果。電化學(xué)方法在溫和反應(yīng)條件下進(jìn)行,易規(guī)?；?且不需要加入化學(xué)試劑,是一種環(huán)境友好的預(yù)處理方法。為降低預(yù)處理成本,除了預(yù)處理方法設(shè)計(jì)和改進(jìn)之外,提高底物濃度也是重要的措施之一。在這方面,近年來已報(bào)道了多種高底物濃度預(yù)處理工藝,包括高固CO2-H2O預(yù)處理、高固氨水預(yù)處理、高固稀硫酸蒸汽爆破等。這些預(yù)處理工藝在保證高酶解效率情況下,減少了化學(xué)藥品的投入和水的消耗,因此在規(guī)?；瘧?yīng)用方面更具優(yōu)勢(shì)。2不同結(jié)構(gòu)特性對(duì)纖維素酶解的影響木質(zhì)纖維素頑抗特性(包括化學(xué)特性和物理特性)對(duì)纖維素酶解糖化的影響如圖2所示。其中,化學(xué)特性主要有木質(zhì)素和半纖維素;物理特性主要有聚合度、結(jié)晶度、氫鍵、可及表面積和酶可及度。這些結(jié)構(gòu)特性在木質(zhì)纖維素預(yù)處理過程中發(fā)生了不同程度的破壞,從而提高纖維素的酶解效率。在特定預(yù)處理?xiàng)l件下,這些結(jié)構(gòu)也并非單一性改變,而是互相聯(lián)動(dòng)變化。因此,準(zhǔn)確描述單個(gè)頑抗特性對(duì)纖維素酶解的影響機(jī)制仍較為困難,盡管如此,經(jīng)過大量的研究,可以較清晰地了解木質(zhì)纖維素的頑抗特性及其對(duì)纖維素酶解的影響規(guī)律。下面分別討論各頑抗特性在預(yù)處理過程中的變化,并分析其對(duì)酶解糖化的影響機(jī)制。2.1化學(xué)特征2.1.1酶解纖維素木質(zhì)素是由苯丙烷結(jié)構(gòu)單元組成的一類復(fù)雜的芳香聚合物。在木質(zhì)纖維素中,木質(zhì)素與半纖維素以化學(xué)鍵鏈接,并纏繞和包裹在纖維素周圍,阻礙了纖維素酶與纖維素的接觸。因此,很多預(yù)處理方法都是旨在脫除木質(zhì)素來解除對(duì)纖維素的包裹。堿處理可以破壞木質(zhì)素和半纖維素之間的化學(xué)鍵,具有較強(qiáng)的脫木質(zhì)素能力,如氨水浸泡、氨爆處理和石灰預(yù)處理等。此外,超聲/H2O2-生物組合預(yù)處理亦可有效脫除木質(zhì)素。木質(zhì)素(不同含量與種類)主要通過以下兩種作用方式影響纖維素的酶解效率:(1)阻礙纖維素酶分子接近纖維素糖苷鍵;(2)木質(zhì)素對(duì)纖維素酶產(chǎn)生不可逆吸附,大大降低了纖維素酶的有效性。據(jù)報(bào)道,木質(zhì)素的疏水性是產(chǎn)生纖維素酶無效吸附的一個(gè)重要因素,在酶解過程中加入表面活性劑(如吐溫)或非離子化合物(如牛血清蛋白、聚乙二醇等)與酶蛋白產(chǎn)生競(jìng)爭吸附,可提高纖維素酶解效率。木質(zhì)素制約纖維素酶解早有報(bào)道,近年來,Zhu等提出脫木質(zhì)素對(duì)纖維素水解程度有影響,但對(duì)初始酶解速率影響不明顯。當(dāng)木質(zhì)纖維素結(jié)晶度破壞時(shí),高木質(zhì)素含量的底物仍可在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到高的水解率?？赡茉蚴堑孜锝Y(jié)晶度破壞后,結(jié)構(gòu)松散,可及表面積增大,酶很容易甚至優(yōu)先與纖維素結(jié)合,此時(shí)木質(zhì)素阻礙和無效吸附作用不足以影響纖維素的酶解。本課題組結(jié)果亦表明在較大的酶可及表面積情況下,含少量木質(zhì)素[如<10%(質(zhì)量)]的底物也能達(dá)到高的酶解轉(zhuǎn)化率。因此,在預(yù)處理過程中并非必須完全脫除木質(zhì)素。2.1.2半纖維素含量對(duì)酶活性的影響半纖維素是主鏈由木聚糖或半乳糖等組成,且?guī)в兄ф湹囊活惤Y(jié)構(gòu)不同的多聚糖。半纖維素聚合度低,無結(jié)晶結(jié)構(gòu),在酸處理(如稀硫酸)過程中容易發(fā)生水解。半纖維素的水解會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,可使纖維素酶更容易接近纖維素。Jeoh等考察了稀硫酸預(yù)處理后玉米秸稈中半纖維素含量對(duì)酶可及度的影響規(guī)律。研究發(fā)現(xiàn):反應(yīng)1h吸附在底物上纖維素酶濃度隨著半纖維素(木聚糖)含量的減少而增大,由此直觀證明了半纖維素含量的減少有利于底物對(duì)纖維素酶的吸附;而玉米秸稈經(jīng)氨水浸泡處理后,半纖維素含量基本不變,但是纖維素酶解轉(zhuǎn)化率可達(dá)85%以上,這是由于目前商業(yè)化纖維素酶(如SpezymeCP)基本上都含有木聚糖酶,當(dāng)半纖維素與木質(zhì)素之間的化學(xué)鍵發(fā)生斷裂后,在酶解過程中,多種酶共同作用,相互促進(jìn),可以有效降解纖維素和半纖維素。2.1.3對(duì)質(zhì)層的影響蠟質(zhì)是覆蓋在木質(zhì)纖維素表層的角質(zhì)蠟狀膜,其化學(xué)組成極其復(fù)雜,目前總共鑒定出了一百多種組分,包括脂肪酸、烷烴、脂肪醇、醛類、酮類、酯類化合物等。蠟質(zhì)為脂溶性物質(zhì),可由有機(jī)溶劑(如乙醇、苯)提取。在美國可再生能源實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)方法(NRELLAP10)中,采用乙醇提取法測(cè)定木質(zhì)纖維素中脂溶性物質(zhì)的總含量。但由于蠟質(zhì)組成復(fù)雜,且木質(zhì)纖維素中還有其他脂溶性成分(如葉綠素),因此目前還難以準(zhǔn)確測(cè)定其含量?；谙炠|(zhì)的脂溶性,一些有機(jī)溶劑預(yù)處理,如乙醇蒸煮、磷酸-乙醇、磷酸-丙酮等,可破壞木質(zhì)纖維素表層的蠟質(zhì)層。Chen等采用蒸汽爆破-乙醇提取法處理小麥秸稈,化學(xué)分析能譜測(cè)試結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙醇提取后秸稈表層的O/C值增大,這有可能是乙醇脫除了蠟質(zhì)層和部分木質(zhì)素,從而提高了暴露在表面的纖維素含量。最近,Han等考察了蒸汽爆破預(yù)處理對(duì)木質(zhì)纖維素表面潤濕性的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)處理后表面接觸角明顯減小(由90°可減小到約60°)。由于蠟質(zhì)層的存在可阻礙水分子對(duì)木質(zhì)纖維素表面的潤濕,因此,接觸角減小則表明蒸汽爆破處理破壞了表面的蠟質(zhì)層。已有研究證實(shí)了蠟質(zhì)具有防止木質(zhì)纖維素被有害光線損傷、維持表面清潔與表面防水、避免被微生物侵害等作用。在木質(zhì)纖維素酶解方面,蠟質(zhì)層對(duì)纖維素的包裹及其疏水特性可阻礙酶分子接觸纖維素表面,但直接定量考察蠟質(zhì)層對(duì)纖維素酶解的影響目前還鮮見報(bào)道。2.1.4預(yù)處理技術(shù)研究木質(zhì)纖維素,特別是農(nóng)林廢棄物,含有較多的無機(jī)物,包括硅、鈣、鉀、鋁等離子及其化合物。無機(jī)物組成復(fù)雜,一般采用水洗提取和高溫灼燒處理測(cè)定其總含量。針對(duì)無機(jī)物離子,亦可采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法進(jìn)行定量測(cè)定。由于大部分預(yù)處理過程均在水溶液中進(jìn)行,如氨水預(yù)處理、稀硫酸預(yù)處理等,因此這類預(yù)處理技術(shù)均可除去水溶性無機(jī)物和部分無機(jī)物小顆粒。此外,研究表明蒸汽爆破預(yù)處理有助于無機(jī)物的溶解,進(jìn)而得以脫除。木質(zhì)纖維素中無機(jī)物含量一般在5%~15%,這些無機(jī)物在纖維素酶解過程中溶解在溶液中。Chen等系統(tǒng)考察了蒸汽爆破處理后稻草中無機(jī)物離子對(duì)纖維素酶解的影響,研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)無機(jī)陽離子,包括K+、Mg2+、Ca2+、Al3+、Mn2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+,均一定程度上制約了纖維素酶的水解酶活,這些離子中只有Ca2+和Mg2+對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活具有促進(jìn)作用。與預(yù)處理后不水洗相比,水洗操作可使得纖維素酶解效率提高12.5%,這進(jìn)一步證實(shí)了無機(jī)物離子對(duì)纖維素酶的制約作用。2.2物理特性2.2.1外接酶系統(tǒng)基因酶解效果纖維素聚合度是指纖維素分子中葡萄糖單元的數(shù)量。目前常用的聚合度測(cè)定方法有黏度法和凝膠滲透色譜法。木質(zhì)纖維素聚合度降低,可暴露出更多纖維素鏈還原末端,使外切纖維素酶容易進(jìn)攻,增強(qiáng)酶解效果。目前主要從初始聚合度和水解過程中聚合度的變化來考察其對(duì)纖維素降解的影響規(guī)律。由于木質(zhì)纖維素預(yù)處理導(dǎo)致聚合度變化的同時(shí)也會(huì)引起其他物理特性的變化,如結(jié)晶度、可及表面積等,因此難以準(zhǔn)確描述聚合度的影響機(jī)制。此外,一些預(yù)處理過程并未改變聚合度,亦可達(dá)到高效酶解。2.2.2纖維素在水泥、微生物和離子液體預(yù)處理的過程中水解速率和水率的變化纖維素的結(jié)晶度可采用X射線衍射法、固態(tài)13C核磁共振法、紅外光譜或拉曼光譜進(jìn)行測(cè)定。早期的研究主要以純纖維素為研究對(duì)象,纖維素經(jīng)溶劑處理再生或球磨處理后發(fā)現(xiàn)結(jié)晶度的破壞提高了水解效率。近年來,利用一些新預(yù)處理技術(shù),例如磷酸-丙酮(乙醇)、微波-離子液體、NMO預(yù)處理等,破壞了纖維素的高度結(jié)晶區(qū),處理后纖維素水解速率和水解程度也均顯著提高。另一方面,木質(zhì)纖維素經(jīng)氨水或稀硫酸處理后纖維素結(jié)晶度并未降低,而且由于木質(zhì)素和半纖維素等無定形物質(zhì)的脫除,底物相對(duì)結(jié)晶度指數(shù)反而有所提高,但纖維素在較長時(shí)間酶解后(如24h),也能大部分降解。這些結(jié)果表明:結(jié)晶度的破壞有助于提高水解速率和可水解程度,而高結(jié)晶度的纖維素呈現(xiàn)出較慢的水解速率,但在其他底物特性(如可及內(nèi)表面積)改變后亦能達(dá)到高的可水解程度。無定形纖維素能同時(shí)被內(nèi)切葡聚糖酶(EG)和外切葡聚糖酶(CBH)水解,EG隨機(jī)剪切無定形纖維素分子的糖苷鍵,產(chǎn)生大量供CBH作用的新的分子鏈末端,而結(jié)晶纖維素主要被CBH水解,EG和CBH兩類水解酶的協(xié)同作用在提高纖維素水解速率方面顯得尤為重要。2.2.3纖維素分子間氫鍵強(qiáng)度對(duì)酶解效果的影響木質(zhì)纖維素中纖維素和半纖維素都含有大量的羥基,所以分子內(nèi)和分子間氫鍵是木質(zhì)纖維素一個(gè)重要的物理特性。通過紅外光譜、固體核磁技術(shù)以及借助經(jīng)驗(yàn)公式可定量描述木質(zhì)纖維素分子內(nèi)/間氫鍵強(qiáng)度。研究發(fā)現(xiàn)纖維素的氫鍵對(duì)纖維素的結(jié)晶度有很大的貢獻(xiàn),隨著木質(zhì)纖維氫鍵強(qiáng)度(可能是分子間氫鍵起決定作用)的破壞,結(jié)晶度降低。本課題組系統(tǒng)考察了多種預(yù)處理過程中木質(zhì)纖維素氫鍵強(qiáng)度的變化及其對(duì)纖維素酶解的影響。結(jié)果表明分子間氫鍵的降低有助于促進(jìn)纖維素的水解。酸處理過程中可能由于氫離子的干擾,分子間氫鍵有一定程度的增強(qiáng),纖維素后續(xù)酶解效果不顯著;而堿處理后分子間氫鍵發(fā)生了破壞,纖維素水解率也相應(yīng)提高。2.2.4預(yù)處理對(duì)木質(zhì)素酶可及度的影響在木質(zhì)纖維素酶解過程中,酶分子首先要擴(kuò)散到底物表面或進(jìn)入內(nèi)部孔道才能發(fā)生作用。因此,底物的可及表面積(包括可及內(nèi)、外表面積)是控制纖維素酶解效率的一個(gè)關(guān)鍵因素?？杉皟?nèi)表面積一般通過溶質(zhì)排斥法(soluteexclusiontechnique)和染色法測(cè)定。溶質(zhì)排斥法以不同分子直徑的右旋糖苷或聚乙二醇為分子探針,通過測(cè)量滲入木質(zhì)纖維素內(nèi)部孔道的溶質(zhì)來確定孔體積和可及內(nèi)表面積。由于該方法是在木質(zhì)纖維素濕潤狀態(tài)下進(jìn)行,因此很接近酶解過程的真實(shí)環(huán)境。利用溶質(zhì)排斥法對(duì)預(yù)處理前后的木質(zhì)纖維素進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)纖維素酶解速率和酶解程度與孔徑大于5.1nm的可及內(nèi)表面積呈正比。該孔徑大小與外切葡聚糖酶CBH1催化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)尺寸(5nm×6nm×4nm)相當(dāng)。目前報(bào)道的預(yù)處理方法都能在一定程度上提高木質(zhì)纖維素的酶可及內(nèi)表面,如堿預(yù)處理、蒸汽爆破預(yù)處理、離子液體預(yù)處理等。此外,利用膨脹素、類膨脹素蛋白和其他非水解酶蛋白亦可提高底物的酶可及內(nèi)表面積,促進(jìn)纖維素的水解。在可及外表面積方面,早期研究通過考察顆粒尺寸來間接評(píng)價(jià)可及外表面積的影響。研究發(fā)現(xiàn)顆粒尺寸經(jīng)化學(xué)處理后無明顯變化,對(duì)纖維素酶解轉(zhuǎn)化率幾乎沒有影響;而Zhu等利用機(jī)械碾磨法改變?cè)粕嫉念w粒尺寸,結(jié)果表明增大外比表面積有助于纖維素的水解。實(shí)際上,顆粒尺寸與外比表面積并不呈線性關(guān)系,當(dāng)顆粒尺寸相當(dāng)時(shí),其體積密度或孔隙率很大程度上影響著外比表面積的數(shù)值。因此,綜合考慮底物孔隙率和顆粒尺寸,準(zhǔn)確定量可及外表面積是評(píng)價(jià)其影響機(jī)制的關(guān)鍵。2.2.5纖維素酶可及度木質(zhì)纖維素底物特性較多,并且在預(yù)處理過程中發(fā)生聯(lián)