蝎毒蛋白提取工藝研究

蝎毒蛋白提取工藝研究

蝎子是一種常見的中藥，具有驅(qū)風(fēng)避痙、攻毒結(jié)散、通絡(luò)止痛的功效。蝎子的主要有效組成是：抗腫瘤、鎮(zhèn)痛藥、抗癲癇、抗高血壓、抗炎、抗風(fēng)濕病等。全蝎臨床應(yīng)用多入丸、散,其次入煎劑,因丸、散、煎劑存在服用劑量大,不利于全蝎調(diào)劑現(xiàn)代化等弊端,而入煎劑高溫煎煮是否合理尚未定論。故探討其有效成份蝎毒蛋白提取工藝具有重要意義,我們采用正交設(shè)計(jì)法對(duì)全蝎兩種不同提取工藝進(jìn)行研究,從而得出最佳的提取工藝,現(xiàn)報(bào)告如下。1分散劑的研制754紫外分光光度:上海分析儀器廠出品;TP-1000電子天平:湘儀天平儀器廠出品;超級(jí)恒溫水浴鍋:北京醫(yī)用儀器廠出品;普通離心機(jī):北京醫(yī)用離心機(jī)廠出品;無(wú)水乙醇AR:長(zhǎng)沙東風(fēng)化學(xué)試劑廠出品;全蝎購(gòu)自長(zhǎng)沙市麓山醫(yī)藥公司,經(jīng)湖南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥植鑒定教研室潘清平副教授鑒定合格(山東產(chǎn),一等品)。2方法和結(jié)果2.1檢測(cè)波長(zhǎng)及測(cè)定將蝎毒蛋白定溶于50ml的容量瓶中,取3ml在754紫外光光度計(jì)上用蒸餾水作空白對(duì)照測(cè)出樣品在波長(zhǎng)28nm、260nm的吸光度A280、A260。由于樣品中含有核酸等雜質(zhì)(經(jīng)預(yù)試已證明)。按公式:蛋白質(zhì)濃度C(mg/mg)=1.55A280?0.75A260C(mg/mg)=1.55A280-0.75A260計(jì)算蛋白質(zhì)的濃度,蝎毒蛋白的含量(mg)=50C2.2蝎子全水處理研究重離子處理中蟹毒蛋白的含量稱取已研碎的全蝎粉5.0g,加6倍量的水潤(rùn)濕5min,煎煮(隔水煮沸)3min,共煎煮3次,合并第一、二次的提取液,將合并液與第三次提取液分別離心,取上清液適當(dāng)濃縮后,加等量95%乙醇沉淀(邊加邊攪拌),沉淀用蒸餾水洗滌、振搖、離心,反復(fù)2次,上清液過(guò)濾后定容至50ml,蝎毒蛋白的含量測(cè)定方法同2.1,結(jié)果見表1。試驗(yàn)結(jié)果表明,以蝎毒蛋白含量為指標(biāo),第3次水煎提取所占比例為29.8%,說(shuō)明第3次提取不可少,且考慮到全蝎系貴重藥材,故以水煎提取3次為宜。ssb與sse的合并按表2設(shè)立因素與水平,用L9(34)正交表安排試驗(yàn),稱取9份5.0g全蝎粉水煎煮提取,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3?？紤]到SSB?SSD,這表明B因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沒有影響或影響甚微,可以認(rèn)為該列上的離均差平方和主要是實(shí)驗(yàn)誤差引起的,為了提高分析的精度,將SSB與SSD合并為SSE(相應(yīng)的自由度也合并一起),結(jié)果見表4。以蝎毒蛋白含量為考察指標(biāo),由表3中極差R值大小顯示各因素作用的主次為C>A>B,A因素3水平為佳,B因素的三個(gè)水平差異不大,C因素以2水平為佳;由表4方差分析結(jié)果表明:C因素的影響有非常顯著意義(P<0.01),A因素的影響有顯著意義(P<0.05),故以A3B1C2組合為佳。2.3全豆提取技術(shù)研究高效液相離心時(shí)間稱取已研碎的全蝎5.0g,加4倍量60%乙醇,提取0.5h,共提取3次,合并第一、二次提取液,將合并液與第三次提取液離心、取上清液適當(dāng)濃縮后,各加等量的95%乙醇(邊加邊攪拌),立即離心,沉淀分別加入蒸餾水洗滌、振搖、離心,反復(fù)2次,上清液過(guò)濾后定容至50ml,蝎毒的含量測(cè)定量測(cè)定方法同2.1,結(jié)果見表5。試驗(yàn)結(jié)果表明,以蝎毒蛋白含量為指標(biāo),第三次乙醇回流提取所占比例為23.9%,說(shuō)明第三次乙醇回流提取不可少,且考慮到全蝎系貴重藥材,故以乙醇回流提取三次為宜。現(xiàn)代克氏原螯蝦中加毒蛋白的含量和作用按表6設(shè)立因素與水平,用L9(34)正交表安排試驗(yàn),稱取9份5.0g全蝎粉進(jìn)行試驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表7。以蝎毒蛋白含量為考察指標(biāo),由表7中極差R值大小顯示各因素作用的主次為A>C>B,A因素以1水平為好,C因素以1水平為佳,B因素以1水平較好。由表8方差分析結(jié)果表明:A因素的影響有顯著意義(P<0.05),C因素的影響有顯著意義(P<0.05),故以A1B1C1組合為佳。2.4水權(quán)和乙醇回流提取的模擬結(jié)果從表4與表8中可知在全蝎用量相等(5.0g)的情況下,水煎提取的最佳工藝所得蝎毒蛋白含量為35.25mg,而乙醇回流提取的最佳工藝所得蝎毒蛋白含量為40.26mg;說(shuō)明以乙醇回流提取最佳工藝為好。3全蟹水提取的提取工藝,采用乙醇回流提取。根據(jù)測(cè)定全蟹毒蛋白的含量,將所提取的全蟹水在提取全蝎是中醫(yī)臨床常用的一種名貴藥材,用于許多復(fù)方制劑,多以打粉的形式入藥,這種方法存在諸多弊端,為此我們以蝎毒蛋白的含量為指標(biāo),用紫外分光光度法測(cè)定其含量,通過(guò)采用正交設(shè)