法尼醇x受體的研究進(jìn)展

法尼醇x受體的研究進(jìn)展

法尼醇x受體（rxr）是核受體超家族的成員，主要分布在肝臟、膽囊、腎和腎上腺等組織和器官。FXR的命名來源于1995年的一項(xiàng)研究,該研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)受體可以被法尼醇(farnesol)及其中間代謝物所激活,事實(shí)上法尼醇激活FXR的活性非常弱,并且要在超生理濃度下才能激活FXR。1999年,3個(gè)研究小組同時(shí)獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)膽汁酸(bileacids)在生理濃度下能激活FXR,從而證明FXR是膽汁酸的受體。膽汁酸具有多種生理功能,在脂肪和脂溶性維生素的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)、分配及膽固醇的動態(tài)平衡等過程中發(fā)揮著重要作用。FXR作為膽汁酸的受體,通過調(diào)控參與膽汁酸代謝的基因表達(dá)來維持膽汁酸在體內(nèi)的平衡。最近還發(fā)現(xiàn),FXR在葡萄糖的動態(tài)平衡和胰島素抵抗等方面也發(fā)揮著重要功能。因此FXR有望為高膽固醇血癥、膽囊結(jié)石病、高甘油三酯血癥、膽汁淤積肝病和糖尿病等疾病的治療提供新的方向。自1999年發(fā)現(xiàn)膽汁酸能激活FXR,從而產(chǎn)生多種生理功能以來,尋找具有選擇性和高活性的FXR配體便成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。近幾年,FXR新型激動劑和拮抗劑的發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化以及晶體結(jié)構(gòu)解析等方面都有了突破性進(jìn)展,為基于FXR的新藥開發(fā)提供了新的思路。本文綜述了FXR在激動劑和拮抗劑研究上的最近進(jìn)展,著重分析了激動劑的類型和構(gòu)效關(guān)系,并比較分析了FXR復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)特征。1fr激動劑FXR的激動劑按結(jié)構(gòu)可分為甾體類和非甾體類激動劑。以此分類,本文將對代表性的化合物及其構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行介紹。1.1體類fr激動劑1.1.1cdca的c-17位取代衍生物活性鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholicacid,CDCA,化合物1)是迄今發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的FXR天然配體膽汁酸,其EC50為10~50μmol·L-1。2002年P(guān)ellicciari等報(bào)道了第一個(gè)合成的高活性甾體類FXR配體6-乙基鵝脫氧膽酸(6ECDCA,化合物2),其胞外的活性EC50值達(dá)到99nmol·L-1,細(xì)胞水平的活性為85nmol·L-1。大鼠體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,6ECDCA有降低膽固醇的活性。自6ECDCA被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道以來,它就成為研究FXR功能的工具化合物之一。為進(jìn)一步研究CDCA的構(gòu)效關(guān)系,2004年P(guān)ellicciari等報(bào)道了CDCA的A/B環(huán)和C-17位側(cè)鏈結(jié)構(gòu)修飾的衍生物。研究發(fā)現(xiàn),A環(huán)3位的羥基對活性的影響較小,而B環(huán)6位的取代對化合物的活性影響較大。當(dāng)6位用疏水性的脂肪鏈基團(tuán)(如丙烯基、丙氰基)取代時(shí),衍生物活性比母體化合物CDCA活性略有提高;當(dāng)6位用親水性基團(tuán)(如丙醇、羥基、甲氧基等)取代時(shí),化合物活性明顯降低。這可以歸因于FXR結(jié)合口袋的疏水性本質(zhì)。當(dāng)親水性基團(tuán)結(jié)合在疏水性口袋時(shí),需要更多的去溶劑化能穩(wěn)定其結(jié)合。C-17位側(cè)鏈取代的構(gòu)效關(guān)系則相對復(fù)雜。當(dāng)22位或23位引入羥基后,衍生物活性均有下降。在22位和23位的取代環(huán)丙化后,活性有不同程度的下降,說明在C-17位伸展型的側(cè)鏈有利于活性的提高。另外,C-17位的羧基被其他的能提供氫鍵受體的基團(tuán)(如磺酸基)取代后能維持其活性;將C-17位側(cè)鏈的羧基(-COOH)用氨基(-NH2)取代后(化合物3,NCDCN),其活性和效力(efficacy)和CDCA幾乎相當(dāng)。不過,這些系列化合物均只報(bào)道了細(xì)胞外的活性,而沒有細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)?；贔XR與CDCA晶體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析,Pellicciari等發(fā)現(xiàn)CDCA的C-17位側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)改變可能和FXR選擇性調(diào)節(jié)下游靶基因功能相關(guān)?；谶@種思想,在化合物3(NCDCN)的基礎(chǔ)上,Pellicciari等設(shè)計(jì)合成了一系列CDCA的C-17位取代衍生物,并測得了它們的胞外和細(xì)胞水平的活性?；钚詫?shí)驗(yàn)測試發(fā)現(xiàn),所設(shè)計(jì)合成的8個(gè)衍生物均有較好的胞外活性,活性好于CDCA。細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),4a和4f是激活活性高于CDCA的完全激動劑,而4b~4e是FXR的部分激動劑。由于CDCA的C-17位取代衍生物,既能得到完全激動劑,又能得到部分激動劑,因此,這一類型的衍生物有望開發(fā)成為FXR的選擇性調(diào)節(jié)劑。Gioiello等最近在上述化合物4h的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步在4h的B環(huán)的6位引入6α-乙基,以期增強(qiáng)化合物的活性。所設(shè)計(jì)的新化合物5,用Alphasceen方法測得的胞外活性EC50值為0.15μmol·L-1,高于6ECDCA(EC50為0.20μmol·L-1),并且其結(jié)合效力也高于6ECDCA。細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)表明,化合物5是一個(gè)完全激動劑,激活活性和6ECDCA相當(dāng)。分子對接模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),化合物4h和化合物5以相似的模式結(jié)合在FXR的口袋,但化合物4h主要穩(wěn)定螺旋3,而化合物5主要穩(wěn)定螺旋12,這可能是FXR部分激動劑和完全激動劑不同的激活機(jī)制所在。1.1.2化合物的篩選2008年Merck公司的Soisson等報(bào)道了一個(gè)高活性的FXR激動劑MFA-1(化合物6)。通過高通量篩選技術(shù),作者篩選了約100萬個(gè)化合物的庫,最終發(fā)現(xiàn)了化合物MFA-1具有較高的FXR胞外活性,其EC50約為16.9nmol·L-1。晶體結(jié)構(gòu)表明,盡管MFA-1和6ECDCA有類似的4個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu),但它們在FXR口袋的作用模式則完全不同(具體分析見3.2部分)。1.2非體型fr激動劑1.2.1結(jié)構(gòu)改造對化合物活性的影響2000年Maloney等報(bào)道了第一個(gè)高活性的非甾體FXR激動劑GW4064(化合物7),用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescenceresonanceenergytransfer)法測得胞外激活活性(EC50=15nmol·L-1);其在細(xì)胞水平的EC50值為90nmol·L-1。由于GW4064具有對FXR的高活性和高選擇性,自其被發(fā)現(xiàn)以后就成為探索FXR功能的工具化合物。雖然GW4064在細(xì)胞外和細(xì)胞水平均有非常高的FXR激活活性,但體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GW4064在大鼠體內(nèi)很快被代謝,半衰期非常短。另外,由于其結(jié)構(gòu)含有二苯乙烯基團(tuán),具有潛在毒性。這兩點(diǎn)限制了其成藥性。近幾年,為了優(yōu)化GW4064的藥代性質(zhì),有多個(gè)衍生物的合成相繼被報(bào)道。來自GlaxoSmithKline(GSK)公司的AkwabiAmeyaw等將GW4064結(jié)構(gòu)中的乙烯苯甲酸基團(tuán)用萘甲酸取代,并將中間苯環(huán)的氯用氫取代,這樣既保持了化合物的剛性,又避免了二苯乙烯基團(tuán)。構(gòu)效關(guān)系分析顯示,當(dāng)甲酸在1位或2位時(shí),化合物具有較高的胞外和細(xì)胞水平的活性,其中甲酸在1位取代時(shí)(化合物8,GSK8062),其活性和GW4064相當(dāng),細(xì)胞水平的EC50值達(dá)到了68nmol·L-1(參考化合物GW4064為65nmol·L-1)。當(dāng)甲酸在3位或4位時(shí),化合物的胞外和細(xì)胞水平的活性分別下降約8和40倍。作者通過FXR與GW4064和GSK8062的晶體復(fù)合物結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),這兩個(gè)小分子化合物中的羧基能和FXR第5螺旋上的Arg331形成穩(wěn)定的氫鍵作用。根據(jù)這種結(jié)合模式,作者推測當(dāng)甲酸在3位或4位時(shí),就不能和Arg331形成氫鍵,從而導(dǎo)致其激活活性的降低。在GW4064基礎(chǔ)上,通過結(jié)構(gòu)改造而得到的化合物GSK8062,雖然避免了有潛在毒性的二苯乙烯基團(tuán)且其活性和GW4064相當(dāng),但也存在一些不足,如水溶性以及在大鼠體內(nèi)的口服利用度較差等。為了提高其溶解度以及藥代性質(zhì),GSK公司的Bass等對GSK8062進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造,將萘環(huán)替換成芳香雜環(huán),以期提高親水性。當(dāng)萘環(huán)上的1位或3位用氮取代,即喹啉或異喹啉取代時(shí),化合物具有較高的FXR激活活性,其中喹啉衍生物(化合物9,GSK2324)的細(xì)胞水平活性EC50值為50nmol·L-1。當(dāng)在化合物GSK2324的萘環(huán)4位進(jìn)一步用疏水性的甲氧基、乙氧基、苯氧基等基團(tuán)取代時(shí),各衍生物能保持較高的FXR激活活性,甚至活性有一定程度的提高。根據(jù)FXR與GSK2324的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)分析,萘環(huán)的4位所對應(yīng)的是疏水性的空腔,能容納疏水性的基團(tuán)。雖然這些化合物的活性有一定程度的提高,但由于疏水性基團(tuán)的引入,導(dǎo)致水溶性降低。FXR與GW4064及其類似物GSK8062、GSK2324的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示,其位于一端的羧基基團(tuán)與FXR的Arg331殘基形成靜電及氫鍵作用,并且這些作用對于保持化合物的活性至關(guān)重要。因此GSK的Akwabi-Ameyaw等在GSK8062和GSK2324化合物的基礎(chǔ)上,將萘環(huán)或喹啉環(huán)中的其中一個(gè)6元環(huán)改造成5元環(huán),并研究了羧基的取代位置對化合物活性的影響:(1)當(dāng)萘環(huán)改造為苯并咪唑環(huán),且羧基取代與中間的苯環(huán)呈約90°時(shí),化合物的活性降低約20倍?；钚越档偷脑蚩赡苁囚然恢眠h(yuǎn)離了Arg331殘基,從而導(dǎo)致靜電作用減弱,并且化合物中有兩個(gè)氮原子的引入,升高的去溶劑化能減弱了化合物在疏水空腔的結(jié)合。(2)當(dāng)萘環(huán)改造成苯并噻吩或者吲哚環(huán)(化合物10a和10b),且羧基取代位置與中間苯環(huán)呈約150°時(shí),化合物的活性比母體化合物GSK8062略有提高,其胞外和細(xì)胞水平的EC50值達(dá)到20~30nmol·L-1。這可能是噻吩或吲哚環(huán)上的羧基與Arg331的靜電作用增強(qiáng)所致。另一種可能就是苯并噻吩或吲哚環(huán)上的雜原子和FXR的殘基之間形成了氫鍵作用。(3)當(dāng)萘環(huán)改造成苯并呋喃或苯并吲哚,且羧基位置和中間苯環(huán)呈約210°時(shí),細(xì)胞水平的EC50值約為110~140nmol·L-1。苯并吲哚衍生物與FXR復(fù)合物的結(jié)合模式顯示,衍生物的苯并吲哚環(huán)發(fā)生了180°的反轉(zhuǎn),從而使得羧基與Arg331形成更好的靜電作用,且吲哚環(huán)的氨與Ser342形成了氫鍵作用。雖然經(jīng)過改造后的化合物比母體化合物GSK8062和GSK2324的細(xì)胞水平活性要高,但大鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明這些化合物的半衰期較短,口服利用度較差?；谙嗤乃悸?Akwabi-Ameyaw等將GW4064中間的苯環(huán)和乙烯鍵的近端碳及遠(yuǎn)端碳連接成環(huán)這樣制備了兩個(gè)系列的GW4064衍生物(化合物11和12衍生物)。兩個(gè)系列的主要區(qū)別是:化合物11系列比化合物12系列少一個(gè)可以自由旋轉(zhuǎn)的鍵,這樣剛性比化合物12系列衍生物更強(qiáng)。在化合物11系列衍生物中,當(dāng)成環(huán)為噻吩時(shí),均表現(xiàn)出FXR的激動活性;并且甲酸在間位取代的活性比對位要高這可能是由于對位取代時(shí),和Arg331的距離變大從而導(dǎo)致結(jié)合力變小。當(dāng)成環(huán)為噻唑時(shí),細(xì)胞內(nèi)激活活性比噻吩降低約6倍;當(dāng)成環(huán)為含氮或者含氧的吲哚或噁唑時(shí),激活活性均有不同程度的下降。一種可能的解釋是FXR的結(jié)合口袋是由疏水性殘基構(gòu)成這些含有親水的氮或氧的化合物結(jié)合到疏水性的空腔時(shí),需要更多的去溶劑化能。在化合物12系列衍生物中,當(dāng)成環(huán)為吲哚環(huán)時(shí),化合物活性比GW4064大約下降2倍,這可能是該系列衍生物具有相對大的柔性,使得吲哚環(huán)在FXR的結(jié)合空腔發(fā)生了一定程度的扭轉(zhuǎn)。FXR與GW4064的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)顯示,其異噁唑雜環(huán)深入到FXR結(jié)合口袋空腔,在異噁唑基團(tuán)周圍還有一定的空間進(jìn)行進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造,因此圍繞異噁唑的3位和5位取代,合成了多個(gè)衍生物。GSK公司的Bass等發(fā)現(xiàn),異噁唑的3位側(cè)鏈可以進(jìn)一步延長,在異噁唑環(huán)和二氯苯基之間插入2個(gè)原子,并選擇合適的取代基,衍生物的活性能保持母體化合物的激活活性,甚至略好(化合物13a)。另外苯環(huán)上的取代基大小和位置對化合物的活性影響較大。例如,將雙取代氯換成單氯取代,或者鄰位、間位取代,都會導(dǎo)致化合物活性降低;換成甲基則活性能保持(化合物13b);換成氟和萘則活性降低。由于異噁唑的5位異丙基與周圍受體結(jié)合較緊密,當(dāng)用環(huán)丁基或環(huán)戊基或者較大的3-戊基、異丁基取代異丙基后,活性均有所下降。大鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)實(shí)驗(yàn)顯示,幾個(gè)活性較好的異噁唑環(huán)取代衍生物的口服利用度均很差?；贔XR與GW4064的晶體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)特征,Roche公司的Feng等將GW4064的二苯乙烯基的端基苯環(huán)用氮代吲哚替代,對異噁唑的3位的二氯苯基進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)了一個(gè)結(jié)合活性和物理化學(xué)性質(zhì)均有所提高的氮-氧化吡啶衍生物(化合物14),其胞外活性達(dá)到45nmol·L-1(參考化合物GW4064為64nmol·L-1)。針對化合物GW4064的缺陷,Phenex公司的Abel等也對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造。他們對GW4064的改造主要在3個(gè)部分:異噁唑環(huán)、中間的氯代苯環(huán)和二苯乙烯的乙烯基。對乙烯基的改造主要是將乙烯基的靠近中間環(huán)的碳用甲基氮取代,并將雙鍵改成單鍵;中間氯代苯環(huán)上的氯用三氟甲基取代,中間環(huán)用吡啶取代;異噁唑環(huán)上的異丙基用環(huán)丙基取代或者不取代。改造后得到兩個(gè)化合物15a和15b,具有和GW4064相當(dāng)或略高的胞外和細(xì)胞水平的活性。1.2.2結(jié)構(gòu)新活性化合物2003年,Downes等通過高通量篩選方法得到了活性約為5~10μmol·L-1的苯并哌喃骨架化合物。在此基礎(chǔ)上,通過對這類化合物的不同區(qū)域進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,最后得到了3個(gè)結(jié)構(gòu)新穎且活性高的化合物fexaramine(化合物16,胞外活性EC50為25nmol·L-1)、fexarine(化合物17,EC50為38nmol·L-1)和fexarene(化合物18,EC50為36nmol·L-1)。細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)同時(shí)表明,這3個(gè)化合物能明顯激活FXR。而且,fexaramine、GW4064和CDCA能選擇性地調(diào)節(jié)下游的靶基因。這為開發(fā)選擇性的FXR調(diào)節(jié)劑提供了堅(jiān)實(shí)的依據(jù)。1.2.3取代甲基及苯環(huán)的氟Exelixis公司的研究人員利用高通量篩選技術(shù)從Exelixis公司的數(shù)據(jù)庫篩選得到一類新的FXR激動劑,即氮雜并吲哚類化合物19,其細(xì)胞水平的活性約為0.6μmol·L-1。經(jīng)過對化合物19骨架進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化,Exelixis和Wyeth公司的Flatt等發(fā)現(xiàn),當(dāng)和酯基相連的乙基被異丙基取代,且右側(cè)的苯環(huán)4位連有氟時(shí),其細(xì)胞水平活性和激活效力都有提高。進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化發(fā)現(xiàn),當(dāng)?shù)s環(huán)上連有雙取代的甲基,以及苯環(huán)的3,4位都被氟取代時(shí),得到的化合物(化合物20,XL335)活性最高,其細(xì)胞水平活性EC50達(dá)到4nmol·L-1。大鼠的體內(nèi)試驗(yàn)表明化合物XL335具有較高的口服利用度,有較好的降低膽固醇和甘油三酯的效果。雖然化合物XL335的體內(nèi)和體外的活性均相當(dāng)高,但其水溶性差,口服時(shí)需要借助植物油。為了改善其物理化學(xué)性質(zhì),Wyeth公司Lundquist等對XL335進(jìn)行了結(jié)構(gòu)改造。構(gòu)效關(guān)系研究表明,XL335右側(cè)苯環(huán)的取代基性質(zhì)以及取代基和苯環(huán)之間的連接原子數(shù)對活性影響較大。在苯環(huán)的對位連有嗎啉環(huán),且嗎啉環(huán)與苯環(huán)之間有一個(gè)或兩個(gè)碳相連時(shí),能得到中等活性和效力的衍生物。如果在取代基與苯環(huán)之間再插入一個(gè)氧,則同樣是對位取代的嗎啉衍生物,活性較好。相應(yīng)的間位取代以及將嗎啉環(huán)換成更堿性的其他取代基,則活性會下降。在XL335吲哚環(huán)的8-位或9-位引入氟取代,則會提高化合物的肝微粒體穩(wěn)定性。綜合構(gòu)效關(guān)系研究結(jié)果,最后得到了兩個(gè)物理化學(xué)性質(zhì)優(yōu)于XL335的化合物21a和21b。盡管這兩個(gè)化合物相對于XL335的活性有了6倍下降,但其水溶性有了顯著改善。在大鼠和猴體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果表明,這兩個(gè)化合物在大鼠體內(nèi)能以劑量依賴的方式降低低密度脂蛋白;化合物21b在猴體內(nèi)能降低膽固醇、低密度脂蛋白以及極低密度脂蛋白。這是第一個(gè)在靈長類動物體內(nèi)表現(xiàn)出降脂活性的FXR激動劑。1.2.4化合物32a16b的合成Roche公司的Richter等利用高通量篩選技術(shù),從Roche公司的化合物數(shù)據(jù)庫篩選得到了一類苯咪唑基酰胺類化合物,具有較好的FXR激活活性。通過改變化合物R1、R2和R3部位的取代基,得到了以下的構(gòu)效關(guān)系:當(dāng)R2和R3均為環(huán)己基,R1為4-氯苯基時(shí),衍生物22a的活性最好,達(dá)到0.07μmol·L-1(參考化合物GW4064為0.11μmol·L-1);當(dāng)R1為氰基或甲磺?；葮O性基團(tuán)時(shí),衍生物的活性下降。當(dāng)R1為4-氯苯基,R3為環(huán)己基,R2由環(huán)己基改變?yōu)?-甲丁基、4-四氫吡喃基等,活性均比R2為環(huán)己基時(shí)要低。當(dāng)R1為4-氯苯基,R2和R3為環(huán)己基,在苯咪唑基團(tuán)的苯環(huán)6-位引入甲氧基、雙甲氨、羥甲基等基團(tuán)時(shí),活性比沒有修飾時(shí)要低,但在苯環(huán)5,6位分別引入氟和氯時(shí),活性有了明顯提高,達(dá)到0.013μmol·L-1(化合物22b)。不過其細(xì)胞水平的激活效力只有參考化合物GW4064的43%,因此這類化合物都是FXR的部分激動劑。小鼠體內(nèi)的試驗(yàn)表明,化合物22b具有和GW4064幾乎相同的降低膽固醇、低密度脂蛋白以及甘油三酯的作用。1.2.5神經(jīng)酶fps活性本文作者所在研究組利用虛擬篩選技術(shù),基于FXR和fexaramine的晶體結(jié)構(gòu)模型,發(fā)現(xiàn)了化合物23能明顯激活FXR,其EC50約為5.15μmol·L-1。對其結(jié)構(gòu)進(jìn)一步修飾,并測得細(xì)胞水平的FXR激活活性。結(jié)果表明,B環(huán)3位的甲基可以被氟取代,但如果被三氟甲基取代,則活性會有所下降。1位N的苯基可以被較大的基團(tuán)取代,如硝基苯、氟苯氧基或苯氧基等取代,其中1位N上連有4-氟苯氧基時(shí),化合物活性最高(EC50為1.86μmol·L-1)。1.2.6結(jié)構(gòu)的mbr藥分法最近,Schuster等根據(jù)FXR與不同類型激動劑的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu),構(gòu)建了多個(gè)基于結(jié)構(gòu)的FXR藥效團(tuán)模型?；谶@些藥效團(tuán)模型,虛擬篩選了ChEMBL、DrugBank、NCI等小分子數(shù)據(jù)庫,得到了8個(gè)化合物。經(jīng)過FXR細(xì)胞水平的測試,其中化合物24和25具有較好的FXR激活活性,其EC50值分別為3.15和16.8μmol·L-1。2靶向fbr藥物設(shè)計(jì)的方向由于FXR參與調(diào)節(jié)膽汁酸代謝通路的多個(gè)基因,完全激活FXR,可能會導(dǎo)致生理功能相反的基因同時(shí)表達(dá),這樣就會產(chǎn)生不期望的副作用。例如:研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),雖然激活FXR會降低血漿中甘油三酯和膽固醇的濃度,但同時(shí)會降低高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL)的濃度。激活FXR雖然能誘導(dǎo)抑制因子SHP(smallheterodimerpartner)的表達(dá),抑制膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)活性,從而抑制膽汁酸的生物合成,達(dá)到治療膽汁淤積等肝病的目的;但同時(shí)也會抑制多藥耐受相關(guān)蛋白4(multidrugresistanceassociatedprotein4)的表達(dá),從而加劇肝損傷?；贔XR調(diào)控靶基因的復(fù)雜性以及為克服FXR完全激動劑所導(dǎo)致的副作用,最近有研究組陸續(xù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)FXR的拮抗劑,并認(rèn)為這可能是靶向FXR藥物設(shè)計(jì)的另一個(gè)方向。從天然產(chǎn)物中得到的化合物26(guggulsterone)是第一個(gè)被報(bào)道的具有FXR拮抗活性的化合物,但隨后被證明是FXR的部分激動劑,同時(shí)它也作用于核受體PXR,不具有選擇性。另外,這個(gè)化合物只是在實(shí)驗(yàn)大鼠身上表現(xiàn)出降脂效果,人體實(shí)驗(yàn)并沒有效果。因此guggulsterone并不是一個(gè)真正意義上的FXR拮抗劑。2006年Kang研究組報(bào)道了一類從韓國南海海綿中分離得到的二倍半萜類化合物,具有拮抗FXR的活性。由50μmol·L-1CDCA存在的細(xì)胞共傳染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,化合物27a~27e的IC50值為8.1~81.1μmol·L-1之間,并且沒有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。簡單的結(jié)構(gòu)比較發(fā)現(xiàn),化合物C-12和C-24位的乙?；鶎衔锏霓卓够钚杂兄匾绊?。2011年同一研究組又報(bào)道了一類從韓國海洋生物瘤狀菊海鞘中分離得到的萜類天然產(chǎn)物,在細(xì)胞水平表現(xiàn)出拮抗FXR的活性。其中,化合物28在胞外和細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)中,均表現(xiàn)出拮抗由CDCA引起的FXR轉(zhuǎn)錄活性,其細(xì)胞水平的活性IC50為3.9μmol·L-1,并且完全沒有細(xì)胞毒性。2007年Kainuma等報(bào)道了一類非甾體化合物具有拮抗FXR的活性。作者利用FXR的高活性激動劑GW4064為結(jié)構(gòu)模板,對GW4064不同部位進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造,以期發(fā)現(xiàn)FXR的拮抗劑。將GW4064的苯甲酸的酸性基團(tuán)替換成二級或三級氨衍生物,得到的化合物依然具有激動活性,而沒有拮抗活性。將GW4064兩個(gè)苯環(huán)之間的乙烯基替換成酰胺基或取代的酰胺基,同樣沒有拮抗活性。如果GW4064的異噁唑環(huán)3-位二氯苯基用萘基或雙苯基取代,激動和拮抗活性均消失。將GW4064的異噁唑5位的異丙基用較大的基團(tuán)如萘基和雙苯基取代,得到的化合物29a~29c具有弱的拮抗FXR活性,其IC50約為22~32μmol·L-1之間。進(jìn)一步將上述兩個(gè)化合物中的乙烯鍵替換成酰胺鍵,則拮抗活性提高到3.7~4.0μmol·L-1左右(化合物29d、29e)。Sepe等最近報(bào)道了一類從海洋生物蛇尾海星中分離得到的天然產(chǎn)物——磺化多羥基甾體化合物具有拮抗FXR的活性。分離得到的8個(gè)天然產(chǎn)物都有3α,21-雙磺酸基-4α-羥基取代,基本可以分為兩類:一類在C-17位只有簡單的側(cè)鏈取代,另一類在C-17位的側(cè)鏈進(jìn)一步有支鏈取代。體外細(xì)胞水平測試表明,化合物30具有最強(qiáng)的FXR拮抗活性,能以濃度依賴的方式在100μmol·L-1時(shí),拮抗CDCA誘導(dǎo)的約80%的FXR轉(zhuǎn)錄活性。另外,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),化合物30能選擇性地調(diào)節(jié)FXR下游的靶基因,因而是研究FXR功能的一個(gè)很好的工具化合物。3群體結(jié)構(gòu)發(fā)生基因突變FXR具有典型的核受體的結(jié)構(gòu):一個(gè)位于氮端的DNA結(jié)合區(qū)(DNAbindingdomain,DBD)和一個(gè)位于碳端的配體結(jié)合區(qū)(ligandbindingdomain,LBD)。FXR通常需要與視黃醇X受體(RXR)形成二聚體而發(fā)揮生理功能。當(dāng)有合適的配體結(jié)合到LBD后,引起FXR的激活功能區(qū)2(activationfunction-2,AF2)即螺旋12(helix12)的蛋白構(gòu)象發(fā)生變化,導(dǎo)致輔助遏制物(co-repressor)的釋放,并啟動共激活因子(co-activator)靠近DNA結(jié)合區(qū)從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。因而AF2被認(rèn)為是核受體的一個(gè)調(diào)節(jié)開關(guān)。迄今為止,已有多個(gè)FXR的LBD與激動劑的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)被報(bào)道,這些結(jié)構(gòu)進(jìn)一步闡明了FXR激動劑的作用機(jī)制,并為激動劑的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供了依據(jù)。3.1抗b6ecdca和trp的結(jié)合2003年Rastinejad研究組發(fā)表了第一個(gè)FXRLBD的晶體結(jié)構(gòu),這個(gè)結(jié)構(gòu)是鼠FXR的LBD與6ECDCA的復(fù)合物。晶體結(jié)構(gòu)顯示,螺旋12(H12)處于激動構(gòu)象,即橫于H3、H4以及H11形成的一個(gè)凹槽內(nèi)。處于激動構(gòu)象的H12又與H3及H4構(gòu)成了一個(gè)結(jié)合平臺,以利于激活因子結(jié)合。激動劑6ECDCA的A環(huán)垂直于BCD環(huán)形成的平面,呈L型結(jié)合于FXR疏水空腔,其結(jié)合模式相當(dāng)獨(dú)特(圖1A)。6ECDCA將其A環(huán)朝向H12,其A環(huán)3位的羥基和H11上的His444形成氫鍵;其D環(huán)側(cè)鏈的羧基與H5上的Arg328形成氫鍵。這種結(jié)合模式和雄激素、雌激素、孕酮等甾體類化合物在其相應(yīng)受體結(jié)合方式完全不同。在這些受體中,甾體化合物是D環(huán)朝向H12,A環(huán)朝向H5,其結(jié)合取向和6ECDCA相反。除了前面所形成的兩個(gè)氫鍵,6ECDCA位于B環(huán)的7位羥基還與H7上Tyr366形成氫鍵作用。另外,位于H11上的His444,其咪唑環(huán)垂直于H12的Trp466的吲哚環(huán),能形成陽離子-π作用。這種His-Trp作用在其他核受體如肝X受體(liverXreceptor,LXR)中也存在,并被認(rèn)為是激活A(yù)F2功能區(qū)的分子開關(guān)。盡管6ECDCA沒有和H12有直接的相互作用來穩(wěn)定H12的激活構(gòu)象,但6ECDCA與His444有直接的氫鍵作用,通過His444的作用傳遞,從而穩(wěn)定H12的激動構(gòu)象。但分子動力學(xué)模擬結(jié)果表明,在缺乏6ECDCA和共激活因子的情況下,H12的構(gòu)象發(fā)生顯著變化,會嚴(yán)重偏離復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)中的激活構(gòu)象,因此單單His-Trp之間的相互作用,還不足以穩(wěn)定H12的構(gòu)象。3.2在形成氫鍵作用的方面的應(yīng)用MFA-1和6ECDCA都是含有4個(gè)環(huán)的甾體結(jié)構(gòu),但MFA-1在FXR空腔的結(jié)合取向和6ECDCA截然相反。MFA-1D環(huán)朝向H12,A環(huán)朝向H5。MFA-1的這種結(jié)合取向,和雄激素、雌激素、孕酮等化合物在其相應(yīng)受體內(nèi)的結(jié)合模式比較相似。位于MFA-1的A環(huán)3位羧基與H5上的Arg331(對應(yīng)于FXR-6ECDCA復(fù)合物中的Arg328)形成氫鍵作用(圖1B)。通過一個(gè)水分子的介導(dǎo),3位羧基還與H3上的His294形成一個(gè)氫鍵網(wǎng)絡(luò)。與MFA-1的D環(huán)連接的羥苯氧基插到FXR疏水口袋的內(nèi)部,其中醇羥基的氧與H3上T288形成直接的氫鍵作用,而苯氧基上的氧則與His447形成弱的氫鍵作用(O與ND的距離為0.357nm)。MFA-1的其余部分則和FXR結(jié)合口袋的疏水性殘基形成強(qiáng)的疏水作用,以穩(wěn)定MFA-1的結(jié)合構(gòu)象。3.3阿利克侖的結(jié)構(gòu)和構(gòu)迄今為止,已有8個(gè)GW4064及其衍生物與FXR的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)被解析發(fā)表[13,14,15,16,17,18,19]。這8個(gè)化合物由于結(jié)構(gòu)基本相似,因此在FXR空腔的結(jié)合模式也基本相同。GW4064一端的羧基和受體H5上的Arg331形成氫鍵和靜電相互作用。異噁唑環(huán)與Trp469(相應(yīng)與FXR-6ECDCA復(fù)合物中的Trp466)形成“邊對面”(edge-to-face)的堆積作用,而異噁唑環(huán)上的氮與H11上的His447形成一弱的氫鍵相互作用(N與ND之間的距離為0.359nm)(圖2)。這兩個(gè)氫鍵作用模式基本和甾體類化合物6ECDCA以及MFA-1相類似。在GW4064衍生物之間,由于取代基團(tuán)的不同,在FXR空腔的結(jié)合模式局部略有差異。例如,GSK8062和GW4064的結(jié)構(gòu)差異在于:GW4064的一端的苯乙烯基被GSK5062中的萘基取代,且羧酸在1-位取代,因此導(dǎo)致羧基和萘環(huán)之間呈約90°,只有一個(gè)氧與Arg331形成氫鍵作用。而在GW4064的結(jié)合模式中,羧基與中間苯環(huán)呈共平面的結(jié)構(gòu),因此羧基的兩個(gè)氧都能和Arg331發(fā)生氫鍵和靜電作用。同樣,當(dāng)GW4064異噁唑環(huán)上的二氯苯環(huán)和異噁唑之間插入兩個(gè)原子時(shí),所形成的衍生物由于側(cè)鏈的延長而導(dǎo)致側(cè)鏈和異噁唑環(huán)之間形成一定程度的彎曲,因此使得異噁唑環(huán)平面偏離了原來的位置。分析所有GW4064與衍生物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),結(jié)構(gòu)的衍生只是使得小分子的結(jié)合模式有少許差異,并沒有顯著改變FXR的殘基構(gòu)象。3.4連苯氨基的基氧和雙鍵作用Fexaramine的結(jié)構(gòu)和上述兩個(gè)甾體以及GW4064有較大的差異,因此其在FXR空腔的結(jié)合模式也有顯著不同。Fexaramine呈T型結(jié)合在FXR口袋,環(huán)己基部分朝向H5和H6;甲氧酯基部分嵌在H3和H6形成的凹槽中;連苯氨基部分則插入到FXR疏水空腔的內(nèi)部,朝向H11和H3(圖3)。和環(huán)己基相連的羰基氧與H3上的His298以及H5上的Ser336形成兩個(gè)氫鍵作用。除了這個(gè)氫鍵,Fexaramine主要靠與殘基的疏水作用而穩(wěn)定在FXR的結(jié)合口袋。與6ECDCA、MFA-1以及GW4064的作用模式明顯不同的是,Fexaramine既沒有和Arg331形成氫鍵,也沒有基團(tuán)和His447有氫鍵作用。另外,由于環(huán)己基伸向H2部位,使得H2靠近溶劑相導(dǎo)致柔性變大,因此在晶體結(jié)構(gòu)中H2的坐標(biāo)缺失。3.5內(nèi)部的疏水性氮雜并吲哚類化合物XL335是個(gè)三環(huán)化合物,其與FXR的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(圖4)顯示,其疏水性的吲哚環(huán)朝向H3和H12,伸入到FXR的結(jié)合空腔內(nèi)部,與FXR內(nèi)部的殘基發(fā)生疏水性結(jié)合。XL335的二氯苯環(huán)則朝向H2和H5,與這兩個(gè)螺旋上的殘基形成疏水作用。XL335氮雜環(huán)與苯環(huán)之間的羰基氧則與H7上的Tyr373形成氫鍵結(jié)合,而異丙酯基上的羰基氧則與H3上的Ala295主鏈氮形成直接氫鍵。與fexaramine相類似,XL335也沒有和Arg331以及His447有氫鍵作用,并且XL335也沒有和H12直接相互作用,因此可能有另外的作用來穩(wěn)定H12的激活構(gòu)象。3.6化合物的苯咪唑環(huán)苯咪唑基酰胺類化合物是FXR的部分激動劑,目前已有7個(gè)苯咪唑基酰胺類的衍生物和FXR復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(圖5)被報(bào)道。這些化合物結(jié)合模式基本相似,呈十字交叉型結(jié)合在FXR口袋?；衔锏谋竭溥颦h(huán)朝向H5和H2,這部分與XL335的作用方式相似。與苯咪唑環(huán)相連的4-氯苯基則伸向FXR的疏水空腔內(nèi)部,并且氯苯環(huán)的平面與苯咪唑環(huán)的平面垂直成約90°。與1位N相連