鹽酸胍誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性特征的吸附反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

鹽酸胍誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性特征的吸附反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

在現(xiàn)代生物化學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域，蛋白質(zhì)的折疊問題是一個(gè)非常感興趣的研究問題。蛋白質(zhì)分子在行使生物功能時(shí)需要特定的三維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)折疊問題是如何形成蛋白質(zhì)的自然結(jié)構(gòu)，即。在一定的氨基酸序列中，多酚鏈?zhǔn)侨绾涡纬傻鞍踪|(zhì)的獨(dú)特結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)相對(duì)容易受到外部因素（溫度、變性劑等）的影響，容易發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致活性喪失和物理性質(zhì)異常變化。在這個(gè)過程中，這個(gè)過程被稱為蛋白質(zhì)變形。根據(jù)1931年的大量實(shí)驗(yàn)工作，吳仙在20世紀(jì)20年代首次提出了蛋白質(zhì)變形的概念。蛋白質(zhì)變形不是由其化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化引起的，而是由空間結(jié)構(gòu)的變化引起的。吳仙的蛋白質(zhì)變量理論被國(guó)際生物化學(xué)界廣泛接受。可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)變形的有許多因素，主要分為兩類：一是化學(xué)因素的變化，包括酸、堿、有機(jī)溶劑、硫酸鈉、鹽酸和表面活性劑；另一種是由熱、射線、x射線和超聲等物理因素引起的。在上述條件下，通過不同的物理和化學(xué)方法，可以確定不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)在變形過程中的革質(zhì)化特征。在實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，隨著退化因素的逐漸增強(qiáng)，不同的物理和化學(xué)方法無(wú)法測(cè)量蛋白質(zhì)的擴(kuò)展。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在同一s的變形曲線上相同。由于不同的物理和化學(xué)方法反映了不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，因此在水質(zhì)變化過程中，物質(zhì)分子的狀態(tài)是自然的，沒有變化。從二氧化學(xué)和化學(xué)動(dòng)力學(xué)的假設(shè)出發(fā)，在平衡條件下，不同的物理和化學(xué)變量模型可以用于測(cè)量。在這項(xiàng)研究中，由于不同的物理和化學(xué)變量模型，可以說是一個(gè)基本的研究方法。對(duì)于一般的行為，由于不同的物理和化學(xué)變量模型，可以證明在物質(zhì)和物質(zhì)作用的變化過程中，物質(zhì)和功能的核心單元在物質(zhì)和物質(zhì)作用方面的變化是不同的。因此，在一般評(píng)價(jià)的條件下，采用化學(xué)法和化學(xué)-動(dòng)力學(xué)作為基本的研究方法，以及不同的物理和化學(xué)變量模型。對(duì)于不同的武狀化分析，雖然不同的半體驗(yàn)公式中測(cè)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是相同的，但從二氧化學(xué)和化學(xué)變量模型可以看出是不同的。從二氧化學(xué)和化學(xué)力學(xué)作為基本的研究方法，可以看出。1fapp與變性因素間的物理轉(zhuǎn)換對(duì)蛋白質(zhì)變性過程的研究得出其遵循二態(tài)模型假說的結(jié)論,其出發(fā)點(diǎn)是考慮到變性曲線呈現(xiàn)為典型S型曲線,認(rèn)為變性過程無(wú)明顯穩(wěn)定的中間態(tài),而所有各步均為瞬態(tài),這一結(jié)論的導(dǎo)出是從分析實(shí)驗(yàn)曲線得到的間接結(jié)果.能夠直接檢驗(yàn)二態(tài)模型假說正確與否的關(guān)鍵是尋找二態(tài)之間存在穩(wěn)定中間態(tài)的證據(jù),中間態(tài)存在的證據(jù)對(duì)于理解蛋白質(zhì)分子解折疊的機(jī)理具有重要意義.在理論上主要是從平衡的觀點(diǎn)出發(fā),采用化學(xué)反應(yīng)平衡方法對(duì)上述轉(zhuǎn)換過程進(jìn)行討論.一般假定總的反應(yīng)可表示為:N?X1?X2??D(1)Ν?X1?X2??D(1)式(1)中每一Xi均為穩(wěn)定的中間態(tài).若用某一物理量y來(lái)跟蹤構(gòu)象變化過程,當(dāng)構(gòu)象變化時(shí)y將隨變性劑或溫度變化而發(fā)生改變.在一定變性劑濃度或溫度條件下,各種成份處于平衡態(tài),觀測(cè)的物理量y由下式給出:y=fNyN+fDyD+∑ifiyi(2)y=fΝyΝ+fDyD+∑ifiyi(2)上式中fN和fD分別為天然蛋白質(zhì)和完全變性蛋白質(zhì)所占的組份,fi為第i個(gè)中間態(tài)所占的組份,yN,yD,yi分別表示蛋白質(zhì)處在天然態(tài)、完全變性態(tài)和第i個(gè)中間態(tài)時(shí),物理參量y所取的值.由歸一化條件可得到:fN=1?fD?∑fi(3)fΝ=1-fD-∑fi(3)并將其代入(2)式中,經(jīng)整理后可以得到表觀變性組份fapp的表示式:fapp=y?yNyD?yN=fD+∑ifidi(4)fapp=y-yΝyD-yΝ=fD+∑ifidi(4)式(4)中di=yi?yNyD?yN(0≤di≤1)(5)di=yi-yΝyD-yΝ(0≤di≤1)(5)一般情況下參數(shù)di在0和1之間取值,即表示第i個(gè)中間體的物理特征值是在天然態(tài)和完全變性態(tài)的值之間變化.從式(4)及(5)可知fapp的數(shù)值一般是與物理性質(zhì)參數(shù)(di)有關(guān).當(dāng)無(wú)中間體時(shí)fi=0,則有fapp=fD,y=fNyN+fDyD,這表明轉(zhuǎn)換過程為二態(tài)過程,此時(shí)fapp與di無(wú)關(guān),fapp與用于實(shí)際測(cè)量的物理參數(shù)di無(wú)關(guān),即對(duì)于不同的物理參量,fapp與變性因素(變性劑、溫度等)之間滿足相同的函數(shù)關(guān)系.在這一結(jié)論基礎(chǔ)上通常設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)去檢驗(yàn)有無(wú)中間態(tài)存在.若有中間態(tài)存在時(shí),得到的fapp值一定隨選取不同物理參數(shù)而發(fā)生變化,因?yàn)槿我籨i值不可能對(duì)于所有測(cè)量的不同的物理性質(zhì)是一樣的.實(shí)際上除了二態(tài)過程外,當(dāng)式(2)中fN=0,fD=0,fi=1時(shí),y=yi,對(duì)選取的不同物理參量,fapp與變性因素之間也可滿足同樣的函數(shù)關(guān)系.這表示在轉(zhuǎn)換過程中所有蛋白質(zhì)分子均處于某一中間態(tài),在此中間態(tài)測(cè)量到的物理參數(shù)值為y.對(duì)應(yīng)于這種情況的變性過程可表示為:N?X1?X2???D(6)Ν?X1?X2???D(6)上式表明在一定變性因素條件下,不是各種組份同時(shí)存在并處于平衡態(tài),而是僅出現(xiàn)某一確定的中間態(tài).所以通常在用不同物理參數(shù)測(cè)定某些蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換過程時(shí),若得到fapp與變性因素之間滿足同樣的函數(shù)關(guān)系時(shí),這并不能說明蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)換過程就一定是二態(tài)過程.實(shí)驗(yàn)上對(duì)尿素誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性過程的分析表明,蛋白質(zhì)變性是一個(gè)構(gòu)象漸變的過程.這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了表示式(5)的正確性.2鹽酸醚誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性蛋白質(zhì)變性實(shí)驗(yàn)表明,蛋白質(zhì)分子在高濃度(6M)的鹽酸胍溶液中將處于完全伸展的構(gòu)象態(tài).鹽酸胍分子的結(jié)構(gòu)反映出,當(dāng)它和其它分子以氫鍵形式結(jié)合時(shí),可以作為質(zhì)子供體,具體分析可知有四個(gè)基團(tuán)可作為質(zhì)子供體.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蛋白質(zhì)分子與鹽酸胍分子之間以形成氫鍵方式相結(jié)合,并且是多氫鍵形式結(jié)合.模型化合物實(shí)驗(yàn)表明,鹽酸胍分子與肽鏈上的兩個(gè)相鄰肽段間可形成一個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu),這種雙氫鍵結(jié)合形式較單氫鍵結(jié)合在水中更穩(wěn)定.Privalov等人對(duì)結(jié)合位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)可以認(rèn)為一個(gè)鹽酸胍分子與蛋白質(zhì)分子主鏈上的兩個(gè)相鄰肽段的羰基氧原子形成雙氫鍵.以下我們將從這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果出發(fā),討論鹽酸胍分子與蛋白質(zhì)分子之間的相互作用機(jī)理.為了便于分析,討論將僅限于單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)分子的變性,絕大多數(shù)單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)變性時(shí),變性過程呈現(xiàn)為典型的S型變性曲線,這表明蛋白質(zhì)變性為一個(gè)協(xié)同過程.為了描述這種協(xié)同作用過程,假設(shè)鹽酸胍誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子的解折疊過程可表示為P+nG?kdkaPGn(7)Ρ+nG?kdkaΡGn(7)(7)式中P表示蛋白質(zhì)分子,G表示鹽酸胍分子,參數(shù)n為Hill協(xié)同系數(shù).ka為鹽酸胍分子吸附到蛋白質(zhì)分子上結(jié)合位點(diǎn)的吸附速率,kd為鹽酸胍分子脫離蛋白質(zhì)分子上結(jié)合位點(diǎn)的脫附速率.對(duì)應(yīng)的穩(wěn)態(tài)速率方程可表示為knaLnfa(θ)=kndfd(θ)(8)kanLnfa(θ)=kdnfd(θ)(8)(9)式中表示鹽酸胍溶液的濃度,fa(θ)是肽鏈上兩個(gè)相鄰的結(jié)合位點(diǎn)未被占據(jù)的幾率,fd(θ)是肽鏈上兩個(gè)相鄰的結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)的幾率.θ為肽鏈上結(jié)合位點(diǎn)被占據(jù)的分?jǐn)?shù),也被稱為肽鏈上結(jié)合位點(diǎn)的復(fù)蓋度.fa(θ)和fd(θ)的表達(dá)式可表示為:fa(θ)=(1?θ)Z(1?θ)Z?θ(9)fd(θ)=(Z?1)2Z(Z?θ)θ2(10)fa(θ)=(1-θ)Ζ(1-θ)Ζ-θ(9)fd(θ)=(Ζ-1)2Ζ(Ζ-θ)θ2(10)參數(shù)Z是配位數(shù),表示一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)附近的最鄰近的結(jié)合位點(diǎn)數(shù).對(duì)于蛋白質(zhì)多肽鏈而言,配位數(shù)Z=2.記K=kakd,KΚ=kakd,Κ表示表觀吸附常數(shù),關(guān)系式(9)又可表示為KnLnfa(θ)=fd(θ)(11)ΚnLnfa(θ)=fd(θ)(11)引入θ的定義θ=y?yNyD?yN(12)θ=y-yΝyD-yΝ(12)將式(9)-(11)代入(12)式可得θ=(ZZ?1)Kn/2Ln/21+(ZZ?1)Kn/2Ln/2(13)θ=(ΖΖ-1)Κn/2Ln/21+(ΖΖ-1)Κn/2Ln/2(13)由式(13)和(14)可得y=yN+(yD?yN)(ZZ?1)Kn/2Ln/21+(ZZ?1)Kn/2Ln/2(14)y=yΝ+(yD-yΝ)(ΖΖ-1)Κn/2Ln/21+(ΖΖ-1)Κn/2Ln/2(14)(13)和(14)式給出了參量θ與鹽酸胍濃度L之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系.當(dāng)(14)式中n=1時(shí),(14)式將化為文獻(xiàn)中的(24.25a)式.從構(gòu)象漸變的觀點(diǎn)看,參量θ表示在變性過程中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象變化的程度,而不是二態(tài)模型假說所描述的處于完全變性態(tài)的蛋白質(zhì)分子所占的分?jǐn)?shù).另外,物理參量y的不同值對(duì)應(yīng)不同的中間態(tài),這表明測(cè)量參量y的變化情況可以跟蹤蛋白質(zhì)變性過程,所以從構(gòu)象漸變觀點(diǎn)所得結(jié)果與二態(tài)模型所描述的過程是有著本質(zhì)區(qū)別的.有關(guān)鹽酸胍誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性的實(shí)驗(yàn)資料已積累很多,實(shí)驗(yàn)上觀察到單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的變性曲線呈現(xiàn)為典型的S型曲線.從上述分析可知鹽酸胍誘導(dǎo)的真實(shí)蛋白質(zhì)的變性為一個(gè)構(gòu)象漸變過程,導(dǎo)出了描述這一過程的關(guān)系式(13)和(14).下面將利用(13)式和(14)式對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的幾種蛋白質(zhì)變性過程進(jìn)行理論分析,并將所得理論結(jié)果與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)相比較.蛋白質(zhì)變性時(shí),表征蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的物理參數(shù)將隨之發(fā)生改變,跟蹤這些參量的變化可以掌握蛋白質(zhì)變性過程的變化規(guī)律.監(jiān)測(cè)圓二色性(CD)和熒光光譜值的變化可用來(lái)跟蹤蛋白質(zhì)變性過程,蛋白質(zhì)變性時(shí)構(gòu)象發(fā)生變化,必然導(dǎo)致跟蹤物理參數(shù)的值發(fā)生變化,若找到物理參數(shù)y與鹽酸胍濃度L的關(guān)系,就可以定量研究在鹽酸胍作用下蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化規(guī)律.下面首先對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的溶菌酶(T4lysozyme)的變性過程進(jìn)行討論.圖1反映了溶菌酶變性時(shí),圓二色性的摩爾橢圓度值隨鹽酸胍溶液濃度的變化關(guān)系.這種變化呈現(xiàn)出典型的S型變化趨勢(shì),反映了溶菌酶在變性過程中其空間結(jié)構(gòu)中的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化,即溶菌酶處在完全變性態(tài)時(shí)分子的空間結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)將消失,當(dāng)式(14)中選取參量值為K=0.38,n=36時(shí),(14)式對(duì)應(yīng)的理論曲線與實(shí)驗(yàn)測(cè)量值符合較好.圖2為糜蛋白酶抑制劑因子2(ChymotrypsinInhibitor2)的變性過程,隨著鹽酸胍濃度的增加,糜蛋白酶抑制劑因子2的熒光光譜值將發(fā)生改變.它反映出糜蛋白酶抑制劑因子2變性時(shí)所經(jīng)歷的構(gòu)象變化過程,當(dāng)(14)式中參數(shù)值取K=0.24,n=22時(shí)理論曲線與實(shí)驗(yàn)值相符合.3鹽酸醚誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性本文在分析以往實(shí)驗(yàn)事實(shí)的基礎(chǔ)上,提出了蛋白質(zhì)分子與一個(gè)鹽酸胍分子之間形成雙氫鍵的相互作用假設(shè).從這一假設(shè)出發(fā)導(dǎo)出了跟蹤變性過程的可觀測(cè)物理參量y與鹽酸胍濃度L之間的關(guān)系式,下面我們將對(duì)以上所得結(jié)果做較深入的討論并從理論上給出某些新的預(yù)測(cè)結(jié)果.3.1在以往的蛋白質(zhì)變性研究中,研究者通常認(rèn)為無(wú)論是變性劑誘導(dǎo)的或溫度誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性,變性后的蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象均是無(wú)規(guī)卷曲線團(tuán).但從本文所提出的蛋白質(zhì)分子與鹽酸胍分子相互作用機(jī)理可知,鹽酸胍分子被吸附到蛋白質(zhì)分子上將導(dǎo)致蛋白質(zhì)多肽鏈具有一定的剛性,而熱變性時(shí)處于完全變性態(tài)的蛋白質(zhì)分子則由于所有弱鍵被破壞而其構(gòu)象為無(wú)規(guī)卷曲線團(tuán),這種效應(yīng)必將反映為同一種蛋白質(zhì)在熱變性和在鹽酸胍變性情況下,所得到的本征粘度值不同,其中由于鹽酸胍誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性時(shí),已完全變性的蛋白質(zhì)分子具有一定的剛性因而具有較大的本征粘度值,這一預(yù)測(cè)結(jié)果與已知的實(shí)驗(yàn)測(cè)量結(jié)果是一致的.3.2圖1表明圓二色性(CD)可用來(lái)跟蹤蛋白質(zhì)變性過程,CD值的變化反映蛋白質(zhì)分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的變化.從圖1可知只有達(dá)到一定的鹽酸胍濃度值時(shí),某種蛋白質(zhì)分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量才會(huì)產(chǎn)生顯著的變化.當(dāng)鹽酸胍濃度逐漸增加時(shí),蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量將逐步減少直至消失.從序變觀點(diǎn)對(duì)鹽酸胍誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)變性可解釋為,在不同濃度的鹽酸胍溶液中蛋白質(zhì)分子處于不同的穩(wěn)定中間態(tài),這些中間態(tài)對(duì)鹽酸胍濃度敏感依賴.蛋白質(zhì)變性時(shí)由于分子內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量發(fā)生顯著變化,必然導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的體積發(fā)生改變,這表明處在不同的中間態(tài)時(shí),蛋白質(zhì)分子對(duì)應(yīng)不同的分子體積,實(shí)驗(yàn)上本征粘度值[η]可以從表觀上反映蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化,通過測(cè)定蛋白質(zhì)變性過程中本征粘度[η]的變化,可確定本征粘度值與鹽酸胍濃度之間的關(guān)系.當(dāng)單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)分子變性時(shí),用不同的物理化學(xué)方法測(cè)定蛋白質(zhì)的伸展程度,所得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都落到同一條S型變性曲線上.這說明若跟蹤變性過程的物理參量y取為本征粘度值,則式(13)和(14)可表示本征粘度[η]隨鹽酸胍濃度L變化的關(guān)系.由于本征粘度[η]與分子體積之間的關(guān)系,我們認(rèn)為式(13)和(14)也可以描述蛋白質(zhì)分子體積隨鹽酸胍濃度變化的關(guān)系.3.3圖2表明通過測(cè)定熒光光譜值的變化也同樣可以跟蹤蛋白質(zhì)變性過程.在蛋白質(zhì)分子中,能發(fā)射熒光的氨基酸殘基,只有Trp、Tyr以及Phe.當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性時(shí),蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,導(dǎo)致上述殘基所處的微環(huán)境發(fā)生變化,從而使測(cè)得的熒光光譜值將隨鹽酸胍濃度的改變而發(fā)生變化.由糜蛋白酶抑制劑因子2(CI2)的天然結(jié)構(gòu)可知,它僅含有一個(gè)埋入其疏水核內(nèi)的Trp殘基.按照構(gòu)象漸變的觀點(diǎn)解釋圖2所顯示的變性過程為:色氨酸殘基的微觀環(huán)境隨鹽酸胍濃度的增加而以漸變形式發(fā)生變化,反映了變性時(shí)芳香族基團(tuán)由分子內(nèi)部非極性環(huán)境逐步暴露于溶劑中.這一過程也必然伴隨著蛋白質(zhì)分子內(nèi)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量和分子體積的同步變化,用不同物理參量監(jiān)測(cè)同一單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的變性過程,所得實(shí)驗(yàn)