脂肪酶熱穩(wěn)定性改造技術(shù)進(jìn)展

脂肪酶熱穩(wěn)定性改造技術(shù)進(jìn)展

脂肪酶（ec3.1.3），即三脂酰干瘦酶，能在油界面中蒸發(fā)三脂酰干物質(zhì)，并能促進(jìn)水分轉(zhuǎn)化為脂肪酸和甘油。它也可以促進(jìn)精細(xì)水介質(zhì)中的酯、酯和酯的交換。它廣泛應(yīng)用于食品加工、手性化合物拆分、洗滌劑、造紙、廢水處理及生物柴油等領(lǐng)域。脂肪酶在工業(yè)應(yīng)用中,往往需要或遇到高溫環(huán)境(溫度通常會(huì)超過(guò)45℃)。天然脂肪酶熱穩(wěn)定性普遍較差,這阻礙了其應(yīng)用范圍。提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性,可通過(guò)對(duì)酶進(jìn)行化學(xué)修飾或分子改造而實(shí)現(xiàn)。分子改造方法包括隨機(jī)突變(RandomMutagenesis),定向進(jìn)化(DirectedEvolution)和定點(diǎn)突變(Site-DirectedMutagenesis)等。定向進(jìn)化和定點(diǎn)突變改造酶的熱穩(wěn)定性,具有更強(qiáng)的目的性和成效性,因而受到更大關(guān)注。1脂肪酶結(jié)構(gòu)與熱穩(wěn)定性已知脂肪酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)雖然同源性差異大,但在空間結(jié)構(gòu)上卻高度保守,屬于α/β水解酶超家族。典型的α/β水解酶主要由8股β折疊片和6個(gè)α螺旋構(gòu)成。脂肪酶結(jié)構(gòu)與典型α/β水解酶結(jié)構(gòu)相比,改變了β折疊片和α螺旋的大小、數(shù)目和位置,但同樣具有保守的催化三聯(lián)體Ser-Asp-His。如圓弧青霉(Penicilliumcyclopium)堿性脂肪酶,具有Ser132-Asp188-His241催化三聯(lián)體(圖1)。催化三聯(lián)體中的Ser及其周?chē)陌被針?gòu)成保守的Gly-X-Ser-X-Gly結(jié)構(gòu)(X表示任意氨基酸)。催化三聯(lián)體處于疏水性的催化口袋底部。催化口袋的口部,往往被一個(gè)或多個(gè)α螺旋的蓋子(lid)結(jié)構(gòu)遮蓋。在油水界面,當(dāng)?shù)孜锶８视王タ拷久傅拇呋诖鼤r(shí),蓋子結(jié)構(gòu)被誘導(dǎo)打開(kāi),底物順利進(jìn)入酶活性中心。脂肪酶與底物結(jié)合后,底物酯鍵的羰基碳原子被附近的氧離子洞捕獲,酯鍵隨即在活性中心被水解。對(duì)脂肪酶熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造時(shí),需注意不能影響催化三聯(lián)體和氧離子洞,不能影響有蓋脂肪酶正常打開(kāi)蓋子結(jié)構(gòu),否則會(huì)影響酶的活性,甚至導(dǎo)致酶的失活。影響酶熱穩(wěn)定性的因素有很多,各因素通過(guò)影響酶分子的柔性而影響其熱穩(wěn)定性。通過(guò)提高分子內(nèi)作用或增加分子表面與溶劑分子的作用,可降低酶分子的柔性而提高其熱穩(wěn)定性。分子內(nèi)作用包括:二硫鍵、氫鍵、鹽橋和疏水作用等。酶分子表面的極性氨基酸殘基,增加了酶與溶劑水的作用而提高其熱穩(wěn)定性。脂肪酶分子中的二硫鍵,氫鍵和鹽橋數(shù)目與酶的熱穩(wěn)定性有一定的正相關(guān)性。例如,已知的擴(kuò)展青霉(Penicilliumexpansum)堿性脂肪酶(PDB:3G7N,最適溫度為34℃)和圓弧青霉(P.cyclopium)堿性脂肪酶(最適溫度為25℃),熱穩(wěn)定性都低,在30℃以上放置后很快失活。這些酶分子中都有兩個(gè)二硫鍵,但與其同源性較高的疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces(Humicola)lanuginosa)脂肪酶(PDB:1DT3,最適溫度為60℃)和米赫根毛霉(Rhizomucormiehei)脂肪酶(PDB:3TGL,最適溫度為40℃)卻都具有3個(gè)二硫鍵(圖2)和較高熱穩(wěn)定性。2酶的殘余酶活性測(cè)定通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助分析目的脂肪酶待引入的熱穩(wěn)定性因素,針對(duì)性更強(qiáng),效果更明顯。隨著信息技術(shù)的發(fā)展,有很多熱穩(wěn)定性相關(guān)的分析軟件可供使用。對(duì)脂肪酶進(jìn)行熱穩(wěn)定性改造,常用的相關(guān)分析軟件或程序名:SWISS-MODEL;ESyPred3D;MODELLER9.9;SWISS-MODEL;PyMol;DiscoveryStudio3.5;NetNGlyc1.0;NetOGlyc3.1;DbD1.20;DiscoveryStudio3.5;GROMACS4.5;B-FITTER;PIC;ccp4-5.0.2;ESBRI;libSVM。酶的熱穩(wěn)定性高低常用熱半失活時(shí)間(t1/2,半衰期),熱半失活溫度(T50)或解折疊溫度(Tm)來(lái)衡量。t1/2是指在一定溫度下,酶活性降低到原來(lái)的一半時(shí)所需時(shí)間,即殘余50%酶活性所需時(shí)間。T50指酶在不同溫度下放置一定時(shí)間后,殘余50%酶活性的溫度。常用Tt50表示在放置t(min)時(shí)間后,殘余50%酶活性的溫度。Tm指酶的結(jié)構(gòu)有一半發(fā)生解折疊時(shí)的溫度。t1/2和T50的計(jì)算可用表觀殘余酶活性測(cè)定來(lái)完成。檢測(cè)Tm的儀器有差示掃描量熱儀(DifferentialScanningCalorimetry),圓二色譜儀(CircularDichroismSpectroscopy),熒光分光光度計(jì)(FluorescenceSpectrophotometer)等。T50和Tm雖然在概念上不同,但是酶蛋白結(jié)構(gòu)解折疊的同時(shí),酶活性也逐漸喪失,因此在有的情況下這兩個(gè)數(shù)據(jù)可以互相參考。3脂肪酶穩(wěn)定方法和應(yīng)用3.1突變子篩選定向進(jìn)化指在實(shí)驗(yàn)室中模擬自然界的進(jìn)化過(guò)程,將目的基因通過(guò)誘變與重組等技術(shù)加速改造,并通過(guò)特定的選擇條件篩選出符合需要的突變子。對(duì)于酶熱穩(wěn)定性改造,先基于隨機(jī)突變、DNA改組和飽和突變等方法將目的基因改造得突變文庫(kù),再結(jié)合高溫條件篩選出耐熱突變子。3.1.1脂肪酶基因隨機(jī)突變對(duì)特定基因進(jìn)行隨機(jī)突變,現(xiàn)在主要通過(guò)易錯(cuò)PCR(error-pronePCR,epPCR)來(lái)實(shí)現(xiàn)。隨機(jī)突變后,需要高通量篩選大量突變樣本才能得到目標(biāo)突變子。黃瑛等通過(guò)易錯(cuò)PCR對(duì)短小芽胞桿菌(Bacilluspumilus)YZ02脂肪酶基因進(jìn)行隨機(jī)突變,酶分子中產(chǎn)生3個(gè)氨基酸改變(S21P,L124H和R112G),突變酶的最適反應(yīng)溫度為45℃(比野生型酶提高5℃),但是熱穩(wěn)定性沒(méi)有明顯變化。Shih等通過(guò)易錯(cuò)PCR將土芽孢桿菌(Geobacillussp.)NTU03脂肪酶基因突變,產(chǎn)生一個(gè)氨基酸改變(E189V),突變脂肪酶的比酶活升高但熱穩(wěn)定性降低。陳彥等通過(guò)易錯(cuò)PCR對(duì)擴(kuò)展青霉(P.expansum)脂肪酶PEL基因進(jìn)行隨機(jī)突變,獲得Tm值提高了3.28℃的突變子。該突變子發(fā)生兩個(gè)氨基酸替換(K82R和E241P),預(yù)測(cè)K82R在遠(yuǎn)離活性中心的α螺旋處能增加鹽橋或氫鍵,E241P能在靠近活性中心的β折疊處增加剛性,這些都增加了酶分子的熱穩(wěn)定性?？傮w來(lái)說(shuō),隨機(jī)突變需要有效的篩選方法和大量篩選突變樣本才能得到理想結(jié)果。3.1.2脂肪酶基因改性DNA改組(DNAShuffling)技術(shù)從1994年誕生以來(lái),已經(jīng)應(yīng)用到很多酶分子的改造中。DNA改組實(shí)現(xiàn)了DNA分子的體外重組,是基因在分子水平上的有性重組(SexualRecombination),主要通過(guò)有性PCR(SexualPCR)或交錯(cuò)延伸程序(StaggerExtensionProcess,StEP)實(shí)現(xiàn)。DNA改組需要與之配套的高通量篩選方法。Akbulut等通過(guò)對(duì)短小芽胞桿菌(B.pumilus)脂肪酶基因的DNA改組,在實(shí)現(xiàn)改組酶催化活性提高的同時(shí),使其在50℃下的t1/2延長(zhǎng)到38.5min,是原始酶的9倍。分析表明,上述改組酶的熱穩(wěn)定性主要源于新替換的氨基酸(G14S,A15G和V109S),使其增加了酶分子結(jié)構(gòu)剛性,減小了分子表面的疏水作用。Niu等通過(guò)易錯(cuò)PCR和DNA改組技術(shù),將少根根霉(Rhizopusarrhizus)脂肪酶RAL定向進(jìn)化,獲得一個(gè)有3個(gè)氨基酸改變(A9T,E190V和M225I)的突變子,其最適溫度提高10℃,50℃下的t1/2延長(zhǎng)12倍。對(duì)原始酶的這3個(gè)氨基酸位點(diǎn)分別定點(diǎn)突變,結(jié)果表明E190V對(duì)熱穩(wěn)定性的提高起決定作用。第190位的Glu位于α螺旋中,將其突變?yōu)槭杷缘腣al,有利于穩(wěn)定α螺旋進(jìn)而有利于整個(gè)脂肪酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定,提高熱穩(wěn)定性。從關(guān)于脂肪酶熱穩(wěn)定性改造的報(bào)道來(lái)看,DNA改組技術(shù)使用頻率并不高,可能原因是操作略顯繁瑣,或是改造效果不理想。3.1.3突變氨基酸的熱穩(wěn)定性飽和突變(SaturationMutagenesis)即點(diǎn)飽和突變,通過(guò)對(duì)目的蛋白編碼基因的改造,使目的蛋白某個(gè)氨基酸被其他19種天然氨基酸分別替代。實(shí)現(xiàn)方法包括寡核苷酸定向誘變(Oligonucleotide-DirectedMutagenesis),盒式誘變(CassetteMutagenesis)和基于PCR的點(diǎn)飽和突變。雖然飽和突變產(chǎn)生的突變子庫(kù)(MutantLibrary)比隨機(jī)突變和DNA改組要小,但是仍需要使用高通量篩選方法。飽和突變與定點(diǎn)突變相比,它能規(guī)避預(yù)測(cè)位點(diǎn)所替代氨基酸的不準(zhǔn)確性。Shih等通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明,土芽孢桿菌(Geobacillussp.)NTU03脂肪酶第189位Glu對(duì)酶熱穩(wěn)定性影響較大,遂將該氨基酸編碼位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變,突變脂肪酶比酶活有升有降,但熱穩(wěn)定性都沒(méi)有提高。Peng通過(guò)B-FITTER程序,計(jì)算出南極假絲酵母(Candidaantarctica)脂肪酶B中B值(BFactor或BValue)較高的氨基酸,然后通過(guò)多點(diǎn)飽和突變,產(chǎn)生兩個(gè)熱穩(wěn)定性比原始酶提高的突變脂肪酶mCALB7和mCALB168,60℃下t1/2分別是原始酶的6倍和14倍。同源模擬結(jié)果分析表明,mCALB7中引入4個(gè)氨基酸改變(P218N,L219K,F220T和V221S),進(jìn)而引入2個(gè)額外的氫鍵并改變了217位到224位之間的結(jié)構(gòu)域。mCALB168中引入4個(gè)氨基酸改變(A57T,T89A,G226R和R168K)進(jìn)而引入3個(gè)額外的氫鍵。迭代飽和突變(IterativeSaturationMutagenesis,ISM)是近年來(lái)對(duì)飽和突變的新發(fā)展。ISM首先通過(guò)計(jì)算B值,確定飽和突變的位點(diǎn)。B值越大的氨基酸位點(diǎn),該位點(diǎn)的可變性越大,在多次單點(diǎn)飽和突變后,選擇某一個(gè)正突變子(熱穩(wěn)定性提高的突變子)為起點(diǎn),將其它的正突變依次重新用飽和突變方法疊加,最終獲得熱穩(wěn)定性大幅提高的多點(diǎn)正突變子。Reetz等利用ISM,將枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)脂肪酶LipA熱穩(wěn)定性大幅提高,最終得到突變子X(jué)(R33A,D34A,K35A,K112C,M134D,Y139C和I157M),其T5060提高了41℃,在55℃下的t1/2延長(zhǎng)了903min。Augustyniak等對(duì)上述突變子X(jué)的熱穩(wěn)定性分子基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),X的熱力學(xué)穩(wěn)定性(thermodynamicstability)比野生型酶略低,即X的剛性并不比野生型酶強(qiáng)。但其動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性(kineticstability)增強(qiáng),在高溫下不易產(chǎn)生不可逆的聚集,進(jìn)而增強(qiáng)了熱穩(wěn)定性。Augustyniak等用NMR方法證實(shí)了動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性增強(qiáng)導(dǎo)致X熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。迭代飽和突變是現(xiàn)有報(bào)道中,對(duì)脂肪酶熱穩(wěn)定性改造最成功的方法。Reetz和Augustyniak等對(duì)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)脂肪酶LipA熱穩(wěn)定性成功改造,將為其他酶的性質(zhì)改造提供有益參考。3.2采用基酸替換產(chǎn)生目的突變子定點(diǎn)突變是指將目的基因中特定堿基突變,進(jìn)而將目的蛋白中指定的氨基酸替換產(chǎn)生目的突變子。定點(diǎn)突變需要對(duì)目的蛋白空間結(jié)構(gòu)有很清晰的認(rèn)識(shí)。對(duì)于脂肪酶的熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造,常要參考熱穩(wěn)定性影響因素并輔以計(jì)算機(jī)軟件分析,在特定位點(diǎn)引入新的氨基酸以引入新的作用力。3.2.1華根霉rhizechine三維脂肪酶的鑒定二硫鍵是影響脂肪酶熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素之一。對(duì)比熱穩(wěn)定性不同的脂肪酶空間結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),耐熱脂肪酶分子中的二硫鍵數(shù)目普遍多于不耐熱的脂肪酶。Yu等人通過(guò)DbD軟件預(yù)測(cè)并替換了華根霉(Rhizopuschinensis)脂肪酶RCL兩個(gè)氨基酸(F95C和F214C),在蓋子結(jié)構(gòu)的絞鏈區(qū)(hingeregion)引入一個(gè)二硫鍵,突變酶在60℃下t1/2延長(zhǎng)到原始酶的7倍,Tm增加了7℃。Han等通過(guò)DbD軟件分析米赫根毛霉(R.miehei)脂肪酶中潛在的二硫鍵,并用GROMACS程序預(yù)測(cè)二硫鍵引入后脂肪酶的熱穩(wěn)定性。結(jié)果顯示,兩個(gè)氨基酸替換(P96C和K106C)后引入一個(gè)新的二硫鍵,使突變子在60℃下t1/2延長(zhǎng)到野生型酶的5倍。3.2.2脂肪酶分子的熱穩(wěn)定性鹽橋是在蛋白質(zhì)分子內(nèi)通過(guò)帶正電荷的氨基酸殘基(Arg,His和Lys)和負(fù)電荷的氨基酸殘基(Glu和Asp)之間相互作用而形成。引入鹽橋同樣能增強(qiáng)脂肪酶分子的對(duì)熱穩(wěn)定性。丁彥蕊等通過(guò)分析色桿菌(Chromobacteriumviscosum)ATCC6918脂肪酶的序列和結(jié)構(gòu)(PDB:1CVL),在活性位點(diǎn)和鈣結(jié)合位點(diǎn)以外的部分提高Glu和Lys的含量,降低A1a、Asp、Thr和Gln的含量,酶分子中鹽橋數(shù)目明顯提高,預(yù)測(cè)了酶的催化活性不受影響情況下熱穩(wěn)定性將大大提高。近年來(lái)通過(guò)引入鹽橋來(lái)提高脂肪酶熱穩(wěn)定性的報(bào)道很少,可能是鹽橋相對(duì)于其他熱穩(wěn)定性因素貢獻(xiàn)較小的緣故。3.2.3脂肪酶b突變體的熱穩(wěn)定性氫鍵是蛋白質(zhì)分子內(nèi)普遍存在的作用力,同樣影響著蛋白質(zhì)分子的熱穩(wěn)定性。通過(guò)氨基替換,額外引入新的氫鍵能增加脂肪酶的熱穩(wěn)定性。孔祥祿等通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬,分析了南極假絲酵母(C.Antarctica)脂肪酶B突變子的熱穩(wěn)定性影響因素,發(fā)現(xiàn)正突變子中氫鍵數(shù)目增加。蔡少麗等對(duì)擴(kuò)展青霉(P.expansum)脂肪酶隨機(jī)突變體ep8基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,ep8突變子(K115R)在40℃下保溫30min,殘余89%酶活性,而同樣條件下ep8只殘余54%酶活性。分析發(fā)現(xiàn),第115位Lys位于α螺旋處,該位點(diǎn)替換為Arg后,由于其pKa比Lys更高,且具有一個(gè)胍基,與周?chē)被釟埢纬蓺滏I多出一個(gè),使得突變子熱穩(wěn)定性更高。隨后在ep8基礎(chǔ)上,該研究組又經(jīng)過(guò)多次單點(diǎn)突變,所獲突變子Tm最高只提高了1.21℃。從現(xiàn)有報(bào)道來(lái)看,少數(shù)氫鍵的引入,并不能使脂肪酶的熱穩(wěn)定性大幅提高。3.2.4突變體表面氨基酸蛋白質(zhì)分子溶于水后,傾向于形成球形,表面分布著較多的極性氨基酸,有利于與水分子作用。不同蛋白分子表面的極性氨基酸占全部氨基酸的比例不同,熱穩(wěn)定性強(qiáng)的蛋白分子表面具有更多的極性氨基酸。Santarossa等定點(diǎn)突變替換莓實(shí)假單胞菌(Pseudomonasfragi)脂肪酶PFL蓋子結(jié)構(gòu)上的氨基酸,突變子(T138N)能提高熱穩(wěn)定性,而突變子(S141G)卻相反。在29℃下保溫4h后,野生型酶和突變子(T138N)分別保留50%和70%酶活性。劉燕雅等對(duì)擴(kuò)展青霉(P.expansum)脂肪酶隨機(jī)突變體ep8基因定點(diǎn)突變,突變子(P197E)的Tm提高了2.25℃。第197位Pro位于酶分子表面的無(wú)規(guī)卷曲部位,突變?yōu)镚lu后改善了酶分子表面親水性,進(jìn)而提高熱穩(wěn)定性。3.2.5氨基酸突變ser蛋白質(zhì)分子中,極性氨基酸多分布在分子表面,而疏水性氨基酸往往隱藏于分子內(nèi)部,使分子內(nèi)部的疏水作用增強(qiáng)。鑒于此,在脂肪酶分子內(nèi)引入疏水氨基酸,能夠在一定程度上提高其熱穩(wěn)定性。Han等通過(guò)對(duì)宏基因組PCR得到的脂肪酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變,突變子(S311C)的熱穩(wěn)定性增強(qiáng),其在60℃下t1/2是原酶的54倍。分析發(fā)現(xiàn),第311位Ser位于蛋白質(zhì)分子表面的α螺旋和β折疊結(jié)合處,靠近于第316位的催化氨基酸Asp,其周?chē)鸀槭杷园被帷Ｌ鎿Q為Cys后,有利于增強(qiáng)第311位點(diǎn)的疏水作用。吳厚軍等對(duì)華根霉(R.chinensis)脂肪酶基因進(jìn)行了定點(diǎn)突變,并提高了該酶熱穩(wěn)定性。突變酶(D190V)在65℃下t1/2比野生型酶延長(zhǎng)了1倍。結(jié)構(gòu)分析表明,該突變氨基酸提高了其所在α螺旋內(nèi)部疏水作用,并產(chǎn)生新的氫鍵,有利于提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性。Wu等將土芽孢桿菌(Geobacillussp.)脂肪酶lipGRD進(jìn)行定點(diǎn)突變,突變子(Y224P)的熱穩(wěn)定性提高,65℃處理5h后仍能保留60%的酶活性。3.2.6易錯(cuò)pcr增加了蛋白分子的熱穩(wěn)定性單因素的引入往往對(duì)酶的熱穩(wěn)定性影響較小,需要多因素疊加才能使酶熱穩(wěn)定性產(chǎn)生更大的改變。在現(xiàn)有報(bào)道中,明確的多因素疊加引入鮮有報(bào)道。多因素的疊加引入需要替換多個(gè)(連續(xù)或散在的)氨基酸。趙偉等通過(guò)對(duì)GenBank錄入的嗜熱和耐熱脂肪酶中單個(gè)氨基酸、二肽片段和三肽片段出現(xiàn)的頻率統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),如單氨基酸Thr、Pro、Met、Phe、Ser、Tyr和二肽KC、EE、KE、RE、VE、YI等在嗜熱脂肪酶中出現(xiàn)的頻率高于其在耐熱脂肪酶中出現(xiàn)的頻率;三肽片段的出現(xiàn)頻率和非相鄰二元組合的序列偏愛(ài)性也顯示與蛋白耐熱性顯著相關(guān)。李劍芳等用多元逐步回歸法分析發(fā)現(xiàn),與所研究脂肪酶最適溫度呈正相關(guān)性的氨基酸二聯(lián)體有IR,KS,NY,SA,ST和YR,多數(shù)位于α螺旋區(qū),且分布在酶蛋白表面;負(fù)相關(guān)性的有DK,DY,IS,KA,WS,YS和QI,多數(shù)位于β折疊區(qū)和無(wú)規(guī)則卷曲區(qū),一般分布于酶蛋白內(nèi)部,并常出現(xiàn)在多肽鏈的N或C端。通過(guò)少數(shù)的位點(diǎn)突變很難大幅提高脂肪酶的熱穩(wěn)定性,但是突變點(diǎn)對(duì)熱穩(wěn)定性的提高效益是可以疊加的,這在迭代飽和突變中也得到了證實(shí)。因此,將易錯(cuò)PCR得到的多個(gè)單點(diǎn)正突變,通過(guò)定點(diǎn)突變或DNA改組等過(guò)程疊加在一個(gè)突變子中,可以使得疊加突變子熱穩(wěn)定性大幅提高。Acharya等通過(guò)易錯(cuò)PCR突變枯草芽孢桿菌(B.subtilis)脂肪酶基因,得到不同單點(diǎn)突變的3個(gè)單點(diǎn)正突變子,每個(gè)單點(diǎn)突變子的熱穩(wěn)定性有所提高但幅度不大。通過(guò)定點(diǎn)突變將3個(gè)單點(diǎn)突變疊加獲得3點(diǎn)突變子TM(N166Y,A132D和L114P)。TM在55℃下t1/2是野生型酶的300倍。分析表明,這些存在于酶分子的表面的疏水性氨基酸,替換成(相對(duì))極性氨基酸后增加了酶分子的熱穩(wěn)定性。以TM基因?yàn)槟０?Ahmad等通過(guò)兩輪易錯(cuò)PCR得到6個(gè)熱穩(wěn)定性略有提高的單點(diǎn)正突變子(A15S,F17S,A20E,N89Y,G111D和I157M),經(jīng)定點(diǎn)突變疊加獲得9點(diǎn)突變子4D3。4D3與野生型酶相比其Tm提高了15℃,熱失活率降低了百萬(wàn)倍。結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),替換后的氨基酸增加了蛋白分子表面的水媒離子網(wǎng)絡(luò)(water-mediatedionicnetwork),使熱穩(wěn)定性增強(qiáng)。隨后,Ahmad等重新選擇了螺旋(helix)末端和環(huán)(loop)連接處的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行飽和突變,產(chǎn)生3個(gè)單點(diǎn)正突變(M134E,M137P和S163P),Kamal等將這3個(gè)正突變疊加到九點(diǎn)突變子上產(chǎn)生12點(diǎn)突變子6B,Tm比野生型酶提高了近22℃。與4D3相比,6B中替換加入的氨基酸能夠降低蛋白分子表面的疏水區(qū)域,能使蛋白質(zhì)在高溫下不聚集進(jìn)而提高熱穩(wěn)定性,而高溫下的蛋白質(zhì)聚集是其對(duì)熱不可逆失活的主要原因。這與Augustyniak等對(duì)枯草芽孢桿菌(B.subtilis)脂肪酶高耐熱突變子的耐熱機(jī)理解釋是一致的。4脂肪高流量篩選法4.1菌株的篩選在原核表達(dá)體系中表達(dá)改造的脂肪酶基因,優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單及篩選和產(chǎn)酶周期短。原核表達(dá)體系有很多,但以大腸桿菌最為廣泛使用。在所見(jiàn)報(bào)道中,用原核表達(dá)體系培養(yǎng)法高通量篩選熱穩(wěn)定性改造的脂肪酶一般選擇3步法:第一步用平板透明圈法初篩;第二步用96孔板熱穩(wěn)定性復(fù)篩;第三步用擴(kuò)大培養(yǎng)來(lái)確認(rèn)。Akbulut等建立了3步篩選法篩選短小芽胞桿菌(B.pumilus)改組脂肪酶。第一步,改組基因連接到pUC19形成重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入E.coliJM109,使用三丁酰甘油酯瓊脂平板初篩能產(chǎn)生透明圈、有活性的突變脂肪酶。第二步,用96孔板培養(yǎng)突變子,將含酶培養(yǎng)液和pNPP(pnitrophenylpalmitate,對(duì)硝基苯基軟脂酸酯)溫浴后在405nm測(cè)酶活性,篩選酶活性高于原始酶的轉(zhuǎn)化子。第三步,在搖瓶水平上培養(yǎng)突變子,以pNPP為底物測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)。Ahmad等也建立了與上述類(lèi)似的3步篩選法。主要區(qū)別在于,此方法第二步篩選先用96孔板對(duì)第一步篩得的陽(yáng)性突變子進(jìn)行培養(yǎng)(產(chǎn)酶),再用96孔PCR板在PCR儀上進(jìn)行熱處理,并與未熱處理的對(duì)比選出熱穩(wěn)定性提高的突變子,用pNPO(p-nitrophenyloleate,對(duì)硝基苯基油酸酯)為底物測(cè)定酶學(xué)性質(zhì)。4.2突變基因庫(kù)的轉(zhuǎn)化用真核表達(dá)體系表達(dá)改造的脂肪酶基因,優(yōu)點(diǎn)在于其具有豐富的表達(dá)后加工,且易于酶的生產(chǎn)和分離。對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究,酵母是很理想的表達(dá)系統(tǒng)。畢赤酵母表達(dá)外源基因(B),需要將基因通過(guò)特定質(zhì)粒重組到酵母基因組中(圖3(a)),因此表達(dá)的異源基因一般是均一、確定的。對(duì)于高通量篩選來(lái)說(shuō),畢赤酵母似乎難以實(shí)現(xiàn)突變基因庫(kù)的整體轉(zhuǎn)化,因此成功的報(bào)道不多。鑒于這樣的思考,Yu等構(gòu)建了在畢赤酵母中高效表達(dá)突變基因庫(kù)的方法。該方法能夠省去把所有基因連接到表達(dá)質(zhì)粒,而后再轉(zhuǎn)化畢赤酵母的麻煩。其要點(diǎn)在于,將突變基因(B),加上與該基因上下游有部分重疊的兩個(gè)片段(A和C,未重疊片段為表達(dá)載體的骨架序列),一起轉(zhuǎn)化畢赤酵母,轉(zhuǎn)入酵母的三個(gè)片段重組成表達(dá)盒后整合入酵母基因組(圖3(b))。產(chǎn)耐熱脂肪酶酵母轉(zhuǎn)化子的篩選分兩步進(jìn)行。初篩:將MD固體培養(yǎng)基上篩選到的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)移到BMMYA固體培養(yǎng)基上,誘導(dǎo)產(chǎn)酶后在高溫下放置1h,在高溫處理的培養(yǎng)物上覆蓋顯色固體培養(yǎng)基(含固藍(lán)RR(FastblueRR)和α萘乙酸),脂肪酶的存在使培養(yǎng)物周?chē)兂缮詈稚?復(fù)篩:將初篩得、能產(chǎn)較高熱穩(wěn)定性酶的酵母轉(zhuǎn)化子,在96孔板上用BMGY和BMMY依次培養(yǎng),誘導(dǎo)產(chǎn)酶,再將酶液轉(zhuǎn)入新的96孔板,高溫(60或65℃)處理后用pNPP測(cè)定酶活性。4.3目的酶的檢測(cè)無(wú)論是原核表達(dá)體系培養(yǎng)法還是真核表達(dá)體系培養(yǎng)法