茶多酚對低密度脂蛋白誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮功能不全的保護(hù)作用

茶多酚對低密度脂蛋白誘導(dǎo)大鼠血管內(nèi)皮功能不全的保護(hù)作用

血管內(nèi)功能不全是動脈樣本硬化（as）的初始階段連接。研究證實血管內(nèi)皮功能不全與自由基產(chǎn)生增多而氧化滅活一氧化氮(nitricoxide,NO)有關(guān)。近來研究證明,內(nèi)源性一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase,NOS)抑制劑如非對稱性二甲基精氨酸(asymmetricdimethylarginine,ADMA)在調(diào)節(jié)NO合成中起重要作用。在慢性高脂血癥動物模型及患者血中ADMA顯著升高,并伴有血管內(nèi)皮舒張功能障礙;外源性給予L-精氨酸可以逆轉(zhuǎn)離體血管環(huán)的內(nèi)皮舒張功能障礙。這些結(jié)果提示NOS抑制劑ADMA的升高是As血管內(nèi)皮功能不全發(fā)生的重要原因。茶葉富含多酚類化合物,即茶多酚,表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate,EGCG)是其主要的活性成分。有研究報道兒茶素可以取消溶血卵磷脂膽堿誘導(dǎo)的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷,與其抗氧化作用有關(guān)。然而EGCG對低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL)誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷是否有保護(hù)作用尚未見報道,本文擬觀察茶多酚的主要活性成分EGCG對LDL所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)效應(yīng),為進(jìn)一步探討兒茶素的藥理作用機制提供一定的實驗依據(jù)。1材料和方法1.1試劑和試劑盒EGCG購自湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司,純度為99%;維生素E購自上海通用藥業(yè)股份有限公司;乙酰膽堿和苯腎上腺素均購自Sigma公司;一氧化氮(nitricoxide,NO)、丙二醛試劑盒購自南京聚力生物有限公司;腫瘤壞死因子α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)試劑盒購于北京東亞免疫技術(shù)研究所;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。1.2ldl蛋白含量測定健康人新鮮血漿,密度梯度超速離心法制備LDL(密度1.019～1.063),分離的LDL置于磷酸緩沖液(pH7.4)充分透析24h,以Lowry法進(jìn)行LDL蛋白含量測定。大鼠在乙醚麻醉下,一次性舌下靜脈注射人血漿LDL(4mg/kg,48h)誘發(fā)血管內(nèi)皮損傷。1.3長期實驗健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,體重180±20g,由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。隨機分為5組,每組8只。對照組實驗前48h舌下靜脈注射等體積的生理鹽水;LDL處理組實驗前48h舌下靜脈注射LDL(4mg/kg);低EGCG組每天腹腔注射EGCG10mg/kg,連續(xù)5天,實驗前48h舌下靜脈注射LDL(4mg/kg);高EGCG組每天腹腔注射EGCG50mg/kg,連續(xù)5天,實驗前48h舌下靜脈注射LDL(4mg/kg);維生素E組每天腹腔注射維生素E50mg/kg,連續(xù)5天,實驗前48h舌下靜脈注射LDL(4mg/kg)。1.4血管張力檢測大鼠在戊巴比妥鈉麻醉下開胸,迅速分離并剪取胸主動脈段,置于充以95%O2和5%CO2混合氣體的改良克氏液中。小心剪去血管周圍結(jié)締組織,剪成約3～4mm的血管環(huán),一端固定于浴槽,另一端連接張力換能器,通過BUXCO生物記錄系統(tǒng)連續(xù)記錄血管張力變化。調(diào)節(jié)靜息張力為2g,平衡60min,加用KCl(60mmol/L)預(yù)收縮血管,沖洗3次后,重新平衡血管環(huán),用苯腎上腺素(10-6mol/L)收縮血管,待穩(wěn)定后觀察累積濃度的乙酰膽堿(3×10-9～10-6mol/L)誘導(dǎo)血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。1.5血漿樣品及標(biāo)準(zhǔn)品的制備頸動脈插管取血5mL,用Na2EDTA抗凝,于4℃下離心15min(3000r/min),收集血漿,用高效液相色譜(HPLC)分析測定血漿中的ADMA含量。取100μL血漿樣品或標(biāo)準(zhǔn)品加入100μL衍生試劑(鄰苯二甲醛與硼酸緩沖液及β-巰基乙醇的混合物),混勻,室溫下反應(yīng)3min后進(jìn)樣,然后用線性梯度洗脫的方式將樣品從色譜柱中洗脫[流動相A為0.05mol/L乙酸鈉(pH6.8)∶甲醇∶四氫呋喃=82∶17∶1,均為體積比;流動相B為0.05mol/L乙酸鈉∶甲醇∶四氫呋喃=22∶77∶1,體積比,流速為1mL/min],經(jīng)預(yù)柱處理后,用RF-10Axl型熒光檢測器對其及內(nèi)標(biāo)ADMA進(jìn)行檢測(激發(fā)波長338nm;吸收波長425nm)。1.6no2-含量檢測生物系統(tǒng)中NO釋放后很快轉(zhuǎn)變成代謝產(chǎn)物NO2-和NO3-,以鎘粉將NO3-還原成NO2-,NO2-通過Griess重氮化反應(yīng)生成有色化合物,用722分光光度計540nm處測定,然后根據(jù)公式計算出NO2-含量以此來反應(yīng)血漿中NO濃度。1.7脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的檢測取100μL血漿,嚴(yán)格按照丙二醛試劑盒(硫代巴比妥酸法)操作,用722分光光度計在532nm處測定每管中硫代巴比妥活性物含量,根據(jù)公式計算血漿中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛的含量。1.8血漿tnf-含量取100μL血漿,嚴(yán)格按照試劑盒的要求,采用放射免疫法測定血漿中TNF-α含量。標(biāo)記TNF和待測樣品中的TNF競爭性地與特異性的抗TNF抗體結(jié)合,通過檢測反應(yīng)物中的放射性來反應(yīng)樣品中的TNF含量。1.9統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)以xˉ±sxˉ±s表示,用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理,組間差異采用Newman-Keuls多重比較t檢驗,雙側(cè)P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1血管內(nèi)皮依賴性擴張單次靜脈注射LDL(4mg/kg)48h后顯著降低大鼠胸主動脈環(huán)對乙酰膽堿誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。10mg/kg和50mg/kgEGCG均能顯著改善LDL對血管內(nèi)皮舒張功能的抑制作用(P<0.01)。維生素E(50mg/kg)也能明顯改善LDL對血管內(nèi)皮依賴性舒張功能的抑制作用(P<0.01),見表1。2.2ecgg對ldl所致adma的影響單次靜脈注射LDL(4mg/kg)增加血漿中ADMA含量(P<0.01)。10mg/kg和50mg/kgEGCG顯著降低LDL所致的ADMA含量升高(P<0.01)。50mg/kg維生素E也明顯抑制LDL所致的血漿ADMA含量升高(P<0.01),見表2。2.3血漿中的氮含量單次靜脈注射LDL后血漿NO含量降低(P<0.01),EGCG和維生素E都能減弱LDL所致的血漿NO含量降低(表2)。2.4血漿丙二醛含量單次靜脈注射LDL明顯增加血漿中丙二醛含量(P<0.01)。10mg/kg和50mg/kgEGCG顯著抑制LDL所致的血漿丙二醛含量升高(P<0.05和P<0.01)。維生素E也有類似的效果(表2)。2.5ecgg對ldl所致血漿tnf-含量的影響單次靜脈注射LDL后血漿中TNF-α含量明顯增加(P<0.01)。10mg/kg和50mg/kgEGCG顯著抑制LDL所致的血漿TNF-α含量升高。維生素E也有類似的效果(表2)。3as血管內(nèi)皮功能不全adma活性的變化血管內(nèi)皮細(xì)胞是存在于循環(huán)血液與血管平滑肌之間的一層屏障,對維持血管結(jié)構(gòu)和功能的完整性具有非常重要的作用,而且可以合成和釋放多種活性物質(zhì)如內(nèi)皮素和NO,參與多種生理和病理生理過程。NO由一氧化氮合酶(NOsythase,NOS)催化L-精氨酸而來,而L-精氨酸同系物如ADMA為內(nèi)源性NOS抑制劑,可與L-精氨酸競爭性抑制NOS活性,減少NO合成。ADMA在體內(nèi)以甲基化蛋白為底物,由甲基化轉(zhuǎn)移酶(proteinargininemethyltransferase,PRMT)催化而成,經(jīng)二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylargininedimethylaminohydrolase,DDAH)代謝失活。動物實驗證明,高膽固醇飼養(yǎng)和高同型半胱氨酸誘發(fā)的As家兔和猴,血中內(nèi)源性ADMA濃度顯著升高,并伴血管內(nèi)皮舒張功能障礙。臨床研究證明,在高血壓、充血性心力衰竭和As等心血管疾病患者血中ADMA顯著升高,并伴血管內(nèi)皮舒張功能障礙;LDL、氧化型LDL(oxidizedLDL,oxLDL)或TNF-α孵育的血管內(nèi)皮細(xì)胞中ADMA含量明顯升高,且與DDAH活性降低有關(guān)。這些研究表明內(nèi)源性ADMA含量升高是As等心血管疾病血管內(nèi)皮功能不全發(fā)生的關(guān)鍵原因。在本實驗中,單次舌下靜脈注射LDL顯著降低血管內(nèi)皮依賴性舒張功能,同時伴有ADMA濃度顯著升高,NO濃度明顯降低,進(jìn)一步支持內(nèi)源性NOS抑制劑ADMA是一種血管內(nèi)皮功能不全的預(yù)測因子。以前的研究表明氧化張力在As發(fā)生發(fā)展過程起著重要的病理生理作用。高膽固醇飼養(yǎng)誘發(fā)的As家兔和糖尿病大鼠血中ADMA升高的同時伴有丙二醛升高;高同型半胱氨酸血癥可使脂質(zhì)過氧化物和ADMA同時升高。有文獻(xiàn)報道抗氧化藥維生素E、普羅布考、PDTC都能抑制血中ADMA含量的升高并改善血管內(nèi)皮舒張功能,這些作用與降低血中脂質(zhì)過氧化物的生成有關(guān)。提示脂質(zhì)過氧化可能是促進(jìn)ADMA升高的一個重要因素。茶是由山茶科植物芽葉加工制成的,茶葉富含多酚類化合物,即茶多酚,基本結(jié)構(gòu)為α-苯基苯并吡喃,占干茶重的30%～35%,茶多酚抗氧化作用與其有效化學(xué)成份有關(guān),主要成分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯、沒食子酰兒茶素和沒食子兒茶素等。其中EGCG含量最高,占兒茶素50%,它的抗氧化作用最強。國人研究發(fā)現(xiàn)EGCG通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),對大鼠缺血再灌注損傷心肌具有顯著的保護(hù)作用。有研究報道兒茶素可以取消溶血卵磷脂膽堿誘導(dǎo)的主動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷,減少LDH的釋放,降低丙二醛水平。本試驗證實EGCG可以明顯地抑制在體大鼠LDL所致的血管內(nèi)皮損傷,且抑制丙二醛和ADMA的升高,說明EGCG對內(nèi)皮的保護(hù)作用與其抗氧化作用有關(guān)。研究表明ox-LDL、氧自由基是內(nèi)皮炎癥因子的潛在誘導(dǎo)物。有文獻(xiàn)報道在體大鼠靜脈注射LDL,LDL快速堆積于血管壁,6～12h被氧化成ox-LDL,誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表面粘附分子P選擇素、細(xì)胞間粘附分子1與TNF-α的表達(dá),并分泌單核細(xì)胞趨化因子,進(jìn)一步擴大動脈內(nèi)膜的炎癥反應(yīng),損傷血管內(nèi)皮功能。本研究發(fā)現(xiàn),外源性LDL能引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,EGCG能改善LDL所致血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,說明兒茶素