兔骨髓基質干細胞生長特點及成骨特性的研究

兔骨髓基質干細胞生長特點及成骨特性的研究

骨層的種子細胞通常來自骨膜、骨組織和骨髓。前兩種方法由于存在細胞數(shù)量少、移植不良等缺點，不能滿足種子細胞的需求。而骨髓途徑則具有取材方便、創(chuàng)傷小,細胞繁殖能力強,能適應受區(qū)環(huán)境等優(yōu)點而備受關注。由于骨髓基質干細胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs)具有多向分化潛能,因此如何誘導向成骨細胞分化,則更是近年的研究熱點,本文總結采用兔BMSCs誘導成骨方面的經驗。1材料和方法1.1米松病毒試劑倒置相差顯微鏡(Olympus),Bio-rad450型酶聯(lián)免疫檢測儀(美國METER公司),Ficoll淋巴細胞分層液(上海試劑二廠),低糖DMEM(美國Gibco公司)地塞米松β-甘油磷酸L-壞血酸(德國Sigma公司),堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物制品公司),新西蘭大白兔(蘇州大學動物中心)。1.2細胞誘導分化1.2.1細胞原代培養(yǎng)取3月齡新西蘭大白兔1只,雌雄不限,3%戊巴比妥(1ml/kg)靜脈麻醉,經轉子窩抽取骨髓約4ml置于肝素化的試管內,運用Ficoll淋巴細胞分層液分離。經密度梯度法離心,1500r/min離心20min,吸取中間的單個核細胞層,接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)瓶內,5天后第1次換液,以后每3天換液1次,約2周細胞基本鋪滿單層后進行傳代。1.2.2傳代和誘導分化待細胞鋪滿單層后用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶2比例傳代接種。取第3代生長良好的骨髓基質細胞分2組,加入誘導劑組為實驗組,加入1×10-8mol/L的地塞米松、50μg/L的L-壞血酸(AA)、10mmol/L的β-甘油磷酸(β-Gp)進行誘導分化,對照組不加誘導劑常規(guī)培養(yǎng),用倒置顯微鏡逐日對誘導細胞的形態(tài)進行觀察。1.2.3MTT法測定細胞增殖,繪制細胞生長曲線取生長良好的第3代細胞,消化制成單細胞懸液,按104/cm2的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,分實驗組和對照組進行培養(yǎng),2天后取每組5孔樣本測試,方法:每孔加入MTT(5mg/ml)20μl,37℃孵育4h后棄上清,再加入二甲亞砜150μl,振蕩10min,于490nm測OD值,以時間為橫坐標、OD值為縱坐標繪制細胞生長曲線。1.2.4細胞堿性磷酸酶(ALP)含量測定及曲線繪制對按上法培養(yǎng)的兩組第3代BMSCs,分別于第2、4、6、8、10、12、14天采集細胞,調整細胞濃度至10×104/ml,取1ml,1000r/min離心10min棄上清液,加入1ml2%TritonX-100,4℃冰箱過夜。取100μl接種于96孔板內,每組5孔,ALP試劑盒作酶聯(lián)免疫檢測,于520nm測OD值,計算出細胞在不同時間ALP活性。以時間為橫坐標,堿性磷酸酶值為縱坐標繪制曲線。1.2.5對誘導培養(yǎng)2周后的細胞進行偶氮偶聯(lián)法和HE染色,對培養(yǎng)3周后的細胞行Von-kossa染色,檢測礦化程度,掃描電鏡觀察成骨細胞形態(tài)。1.3統(tǒng)計方法實驗數(shù)據(jù)用xˉ±sxˉ±s表示,采用t檢驗,以P<0.05為檢驗標準。2細胞增殖和tt法檢測alp活性2.1形態(tài)學觀察(1)骨髓基質細胞細胞懸液在顯微鏡下可見大小不等、折光性好的單個核球形細胞(圖1)。48h內有大量密集的血細胞懸浮于培養(yǎng)液中,3天后骨髓基質細胞仍貼壁不牢,不能形成克隆,故第5天第1次換液(圖2)。第10天細胞即可長滿培養(yǎng)瓶底(圖3),并相互緊密貼附,沿長軸并初步鑲嵌式排列。(2)骨髓基質細胞傳代后呈指數(shù)生長,1∶2傳代2～3天后即可長滿融合,傳代后的細胞呈多角形、短梭形。(3)細胞加入誘導劑后生長較前明顯減慢,逐漸變?yōu)榱⒎叫巍㈠F形或梭形。細胞表面伸出突起且能互相連接,匯合時細胞呈鋪石狀,重疊生長呈“鈣結節(jié)”樣表現(xiàn)(圖4)。連續(xù)培養(yǎng)十幾代后可見胞體變大胞質稀薄,核小染色淡,分裂相少等退行性改變。2.2兩組MTT法測定細胞增殖比較見表1。實驗發(fā)現(xiàn)兩組培養(yǎng)早期細胞增殖能力較強,10～12天達增殖高峰后逐漸下降。實驗組增殖慢,在培養(yǎng)第8天后顯著低于對照組(t=5.14,P<0.05),見表1。2.3實驗組和對照組的ALP活性實驗組和對照組培養(yǎng)基中的ALP活性開始較低,以后逐漸增高,對照組在10～12天時約達到等值。然而實驗組培養(yǎng)基中的ALP活性在培養(yǎng)第8天后,開始顯著高于對照組(t=4.42,P<0.05),見表2。2.4細胞偶氮偶聯(lián)法(圖5)和HE染色(圖6)可見實驗組細胞質內分別為黑色和紅色深染顆粒,而對照組則淡染。Von-kossa染色顯示誘導15天后的細胞間出現(xiàn)致密、圓形不透光團塊片狀的棕染礦化結節(jié)(圖7),而常規(guī)培養(yǎng)后的細胞生長呈現(xiàn)密集單層,無礦化結節(jié)形成。掃描電鏡(SEM)可見誘導培養(yǎng)7天后的骨髓基質細胞有多個細胞突起,表面光滑飽滿,細胞間突起互相聯(lián)結的成骨細胞樣表現(xiàn),并呈重疊生長(圖8)。3細胞分化和alp活性的變化骨組織工程種子細胞獲取的傳統(tǒng)方法為骨組織塊酶消化分段收集法。因步驟繁雜,細胞數(shù)量獲得少,傳代細胞易衰老,不能滿足體外構建需活性成骨細胞數(shù)達到106～107級的要求,更不能滿足大面積骨缺損的構建要求。骨髓基質細胞具有增殖快,傳代細胞不易衰老等特性,近年來發(fā)展的骨髓基質細胞誘導成骨則更具優(yōu)勢,細胞經誘導后需具有較強的成骨能力利于骨構建,故能滿足種子細胞的需求。骨髓分造血和基質兩大系統(tǒng),其成骨能力來源于基質系統(tǒng)的骨髓基質細胞。分離骨髓基質細胞包括全骨髓培養(yǎng)法和離心法,我們將這兩種方法結合起來,在吸取中間單核細胞層同時吸取少量血細胞,既保證多種生長因子的存在,又有利于早期的觀察,取得較好的效果。目前已基本明確骨髓基質細胞需經過骨祖細胞、成骨細胞和骨細胞等分化過程。骨髓基質細胞在體外成骨條件比較特殊,其分化在很大程度上依賴于培養(yǎng)條件,必須依據(jù)于地塞米松、β-甘油磷酸鈉等生長因子存在,才能誘導其向骨細胞方向轉化。Fried等研究表明,糖皮質激素對骨髓基質細胞成骨分化既有促進,也有抑制作用,主要取決于使用的劑量和時間以及細胞所處的階段和細胞種類。本實驗發(fā)現(xiàn),加入誘導劑后,細胞生長較前明顯減慢,而對照組形態(tài)仍為梭形,未見到明顯的鈣化結節(jié)形成。由于地塞米松抑制增殖的同時可明顯增加骨髓基質細胞的ALP活性,其濃度越高作用越明顯。主要機制在于ALP能水解有機磷酸酶,使局部PO43-濃度升高,并可破壞鈣化抑制,從而啟動鈣化。本研究發(fā)現(xiàn)誘導前后ALP活性在8天后顯著增高,10～12天達到峰值,兩組比較差異有顯著性(P<0.05)。McQillan和Takafumi認為β-甘油磷酸鈉可提供磷離子作為堿性磷酸酶的底物,從而加速其鈣化,而且β-甘油磷酸鈉在液體中不能超過2mmol/L,否則不會形成鈣結節(jié)。Maniatopoulos等則認為L-壞血酸能促進體外培養(yǎng)細胞合成膠原形成鈣化,亦能調節(jié)ATP及ALP活性,且影響其合成。本文實驗組細胞偶氮偶聯(lián)法和HE染色可見細胞質內深染顆粒,而對照組細胞生長呈現(xiàn)密集單層,說明β-甘油磷酸鈉和L-壞血酸具有一定的協(xié)同成骨作用。Coelho等發(fā)現(xiàn),Von-kossa染色時,單用β-甘油磷酸鈉到21天時呈弱陽性,L-壞血酸+β-甘油磷酸鈉到28天開始陽性,而地塞米松+β-甘油磷酸鈉+L-壞血酸在21天時,染色即呈陽性,本文對第3代細胞進行誘導分化,3周時Von-kossa染色顯示誘導后的細胞間出現(xiàn)致密、圓形不透光團塊片狀的棕染礦化結節(jié),而常規(guī)培養(yǎng)后的細胞無礦化結節(jié)形成,說明地塞米松、β-甘油磷酸鈉和L-壞血酸確能促進骨髓基質細胞向成骨細胞分化