近紅外光譜對大同烏梅白鳳丸的定性和定量分析

近紅外光譜對大同烏梅白鳳丸的定性和定量分析

熱價分析方法的應用同一烏江白鳳丸由20多種中藥組成。它是北京同益有限公司生產(chǎn)的國家秘密品種。它具有益血健康、調(diào)經(jīng)止血的功效，用于氣血兩虛引起的月經(jīng)不調(diào)。由于同一陰陽白鳳丸與其他制造商生產(chǎn)的飼料差異，因此對其進行了區(qū)分和分析。另一方面，目前，對雞冠花貝氏藥物含量的測定主要是高效液相色譜法和薄面掃描法。這些方法需要復雜的樣品預處理和長期的分析時間，不適用于工業(yè)現(xiàn)場的快速樣品分析。近紅外光譜技術(shù)操作簡單、快速、不會破壞樣品，可以在電子控制方面無法實現(xiàn)，因此在石化、農(nóng)業(yè)、制藥等領(lǐng)域進行了應用。近年來，近紅外光譜在中藥領(lǐng)域的應用越來越廣泛。這顯示出很大的潛力。然而，由于中藥成分復雜，療效多，療效低，因此對近紅外光譜的吸收和重復性不足，因此對中藥的近紅外光譜分析報道甚少。許多樣品是在實驗室中模擬的，因此很難包含實際生產(chǎn)工具的所有信息。在一般方法中，不存在關(guān)于中醫(yī)藥藥物等的詳細紅外分析報道。實驗采用近紅外漫反射光譜法結(jié)合判別分析、相似度匹配和偏最小二乘回歸算法,對同仁烏雞白鳳丸和25個廠家的烏雞白鳳丸進行了鑒別,并建立了同仁烏雞白鳳丸中總氨基酸、芍藥苷和水分含量的定量分析模型.結(jié)果表明,該方法快速、無損、準確、可靠,可推廣用于此類樣品生產(chǎn)過程的定性和定量原位檢測.1實驗方法1.1儀器、試劑和藥物1.1.1儀器、檢測方法Waters2695液相色譜系統(tǒng),Waters2996PDA檢測器,Empower色譜工作站,日立L-8500氨基酸自動分析儀,FW100型高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司),METTLERAE240電子天平,KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),NicoletAntaris傅里葉變換近紅外光譜儀(ThermoNicolet),配置漫反射積分球附件、Result操作系統(tǒng)與TQAnalystV6分析軟件.1.1.2試劑與儀器色譜純甲醇(Merck公司),分析純甲醇、乙醇、鹽酸(北京化學試劑公司),氨基酸分析儀用緩沖液和顯色劑(和光純藥工業(yè)株式會社),水為重蒸餾水.1.1.3熱價下工藝生產(chǎn)芍藥苷對照品由中國藥品生物制品檢定所提供,氨基酸對照品購于味之素公司,同仁烏雞白鳳丸98批,北京白鳳丸15批,白鳳丸22批,由北京同仁堂股份有限公司北京同仁堂制藥廠提供,24個廠家的36批烏雞白鳳丸購于藥店.以上樣品均為水蜜丸,除同仁烏雞白鳳丸按衛(wèi)生部藥品標準WS3-B-3185-98項下工藝生產(chǎn)外,其余均按2005版中國藥典Ⅰ部烏雞白鳳丸項下工藝生產(chǎn).1.2近紅外光譜.取水蜜丸裝滿容積約為25ml的可旋轉(zhuǎn)樣品杯,利用儀器的積分球漫反射采樣系統(tǒng)采集樣品的近紅外光譜.光譜采集條件:以儀器內(nèi)置背景為參比,波數(shù)范圍3800～10000cm-1,掃描次數(shù)50次,分辨率8cm-1.1.3樣品含量與分析方法建立NIR定量模型需要參比方法測定樣品的化學值.采用氨基酸自動分析儀測定樣品中23種氨基酸含量,加和得總氨基酸含量.采用高效液相法測定芍藥苷含量,色譜條件為:C18柱(250mm×4.6mm,5μm),流動相為甲醇-水(30:70),流速1ml·min-1,檢測波長232nm.采用干燥失重法測定了含水量.為擴大模型的適用范圍,制備了不同含水量的樣品,將樣品放入105℃烘箱中干燥0.5～8h,在不同的時間取樣獲取低水分的樣品;將樣品放入裝有飽和KNO3溶液的干燥器中密封0.5～6d,在不同的時間取樣獲取高水分的樣品.樣品各化學值的濃度分布情況如表1.2結(jié)果和討論2.1近紅外光譜數(shù)據(jù)處理同仁烏雞白鳳丸(1)和各廠家烏雞白鳳丸的NIR原始光譜見圖1.從原始近紅外光譜圖中很難直接鑒別同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸,一方面是由于中成藥成分眾多,組成復雜,因此難以從原始近紅外光譜中找出特定的吸收譜帶對其加以區(qū)分;另一方面是由于同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸的主要原料藥材和輔料均相同,這些相同成分的吸收峰往往掩蓋了代表特征信息成分的吸收峰,使得其NIRS圖非常相似,不能簡單以峰位、峰形鑒別法進行分類,必須經(jīng)過數(shù)學處理,提取到特征信息進行分類鑒別.為減小實驗過程中樣品顆粒尺寸、均勻性等因素對近紅外光譜的影響,采用多重散射校正技術(shù)(MultiplicativeScatterCorrection,MSC)對原始近紅外光譜進行處理.光譜基線的漂移則通過微分處理加以校正.一階微分處理可以消除常數(shù)背景,二階微分可以消除線性背景.圖2～3分別為依次經(jīng)MSC、Norris導數(shù)平滑濾波和一、二階微分處理后得到的光譜圖,從中可以看出,近紅外光譜在經(jīng)MSC和微分處理后,不僅可以較好地消除基線偏移,還可以更為細致地反映樣品的光譜特征.在對光譜數(shù)據(jù)作微分處理時,由于噪聲信號也被放大,因此通常在微分之前需要對光譜數(shù)據(jù)作平滑處理.2.2天麻雞白鳳丸和天麻白鳳丸的主成分分析主成分分析是將原變量進行變換,用數(shù)目較少的新變量代替原變量,且新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征,同時去除無用信息.原始光譜數(shù)據(jù)經(jīng)MSC、Norris導數(shù)平滑和一階微分處理后,對其進行主成分分析,前3個主成分代表了98.17%的信息.以前3個主成分得分析作圖,如圖4.從圖中可以看出,同仁烏雞白鳳丸在主成分特征空間上的分布較為集中,烏雞白鳳丸因來自多個廠家,分布較為分散.類別之間存在交叉,故直接采用主成分分析法難以準確地對同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸進行鑒別.2.3區(qū)分分析2.3.1方法的應用.主成分分析-馬式距離法.對于是否正確處理主成分分析和發(fā)現(xiàn)的一個樣品,其重點在于用主成分分析-馬式距離法進行判別分析,并將樣品分為主成分分析和發(fā)現(xiàn)判別分析法是常用的化學計量學定性方法,其基本思想是根據(jù)已知樣品集特征,選定適合的判別準則,建立定性分析模型,最后用于預測未知樣品.在各種判別分析方法中,主成分分析-馬式距離法是一種較為實用的方法.當用本方法分析一個未知樣品時,軟件對標準光譜進行主成分分析,用標準光譜主成分分析的結(jié)果來確定未知樣品的得分值,得分圖用來計算樣品到每個類別的馬式距離,距離的值越接近于零,該樣品與標準光譜越相似.實際分析過程中,當標準光譜不止一類,未知樣品被判為與之馬式距離最短的那一類.實驗采用主成分分析-馬式距離法進行判別分析.2.3.2判別分類模型的建立及驗證隨機選取同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸樣品各10份組成驗證集,其余樣品組成校正集.實驗中比較研究了三種預處理方法(不經(jīng)處理;依次經(jīng)MSC、Norris導數(shù)平滑和一階微分處理;依次經(jīng)MSC、Norris導數(shù)平滑和二階微分處理)處理后的光譜在不同波數(shù)范圍內(nèi)選用不同的主成分數(shù)建立的判別分析模型的分析結(jié)果,在波數(shù)范圍為6500～8000cm-1的區(qū)間,經(jīng)MSC、Norris導數(shù)平滑和一階微分處理,主成分數(shù)為35時建立的模型最佳,誤判數(shù)為0.而采用原始光譜和二階微分處理后誤判數(shù)分別為19和12.經(jīng)優(yōu)化參數(shù)后最終應用主成分分析-馬式距離法建立了同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸的判別分類模型,取得了較好的效果,模型分類結(jié)果見圖5,由圖可直觀地看出,樣品明顯聚為兩類.用此模型對驗證集樣品進行判別,均獲得了正確的分類.2.4相似度分析2.4.1gram-schmidt分析相似度匹配方法通過比較未知樣品與已知標準光譜在某個或多個波段的光譜信息,得到樣品與標準品的匹配程度.該算法對標準光譜進行Gram-Schmidt分析,得到的正交模型代表了所有標準光譜中全部數(shù)據(jù)點提供的光譜信息.在對樣品進行分析時,使用Gram-Schmidt模型將樣品光譜中該模型包含的所有光譜信息去除得到樣品的殘差光譜.最后,將樣品光譜同其殘差光譜相比較得到“相似度”.相似度的范圍為0～100,其值越高,說明未知樣品與標準樣品的光譜越相似.2.4.2預處理方法的選擇以70批同仁烏雞白鳳丸作為標準樣品組成校正集,建立了相似度計算模型,將其用于計算其余28批同仁烏雞白鳳丸及58批烏雞白鳳丸的相似度.由于中成藥組成復雜,為充分利用其光譜信息,因此選擇全譜范圍(3800～10000cm-1)進行建模.實驗中比較研究了三種預處理方法(不經(jīng)處理;依次經(jīng)MSC、Norris導數(shù)平滑和一階微分處理;依次經(jīng)MSC、Norris導數(shù)平滑和二階微分處理)處理后的光譜所建立的模型對樣品的分析結(jié)果,結(jié)果以第三種預處理方法處理后的光譜建立的模型可以最為細致地反映不同樣品的差別.而采用原始光譜和一階微分光譜進行預處理建立模型,計算得到的同仁烏雞白鳳丸與烏雞白鳳丸相似度沒有明顯的閾值.2.4.3天麻雞白鳳丸和天麻白鳳丸的比較將未參與建庫的樣品的近紅外光譜輸入前述所建立的模型,計算其與標準樣品的相似度,見圖6.所有樣品的相似度最小值為29.81,最大值為99.79.同仁烏雞白鳳丸相似度范圍為99.10～99.79,同仁堂制藥廠生產(chǎn)的烏雞白鳳丸相似度范圍為97.90～98.79,其他廠家生產(chǎn)的烏雞白鳳丸相似度范圍為29.81～97.85,表明該方法能反映不同產(chǎn)品的差別,可以將同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸區(qū)分開來.將域值設定為99.00,一旦未知樣品光譜相似度超過此值,該樣品被認定為同仁烏雞白鳳丸.2.5定量分析2.5.1主因子數(shù)的選擇偏最小二乘法(partialleastsquare,PLS)是近紅外光譜分析中使用較多、效果較好的一種多變量校正方法,通過對變量系統(tǒng)中信息中心進行綜合篩選,從中選取若干個對系統(tǒng)具有最佳解釋能力的新綜合變量進行回歸建模.在PLS建模過程中,主因子數(shù)的選擇是優(yōu)化模型的關(guān)鍵步驟.如果建立模型時使用的主因子數(shù)過少,就不能反映未知樣品被測組分產(chǎn)生的光譜變化,其模型預測準確度就會降低,這種情況稱為不充分擬合;如果使用過多的主因子建立模型,就會將一些代表噪音的主成分加到模型中,使模型的預測能力下降,這種情況稱為過度擬合.為充分提高光譜信號的有效信息利用率,同時避免出現(xiàn)“過擬合”現(xiàn)象,需要對主因子數(shù)進行合理選擇.可采用內(nèi)部交叉驗證法,考察主因子數(shù)對交叉驗證均方差(rootmeansquareerrorofcrossvalidation,RMSECV)的影響,選取RMSECV最小時的主因子數(shù)建模.2.5.2仁雞白鳳丸的多元校正模型譜區(qū)范圍、預處理方法和主因子數(shù)的選擇是決定所構(gòu)建的近紅外模型質(zhì)量高低的關(guān)鍵因素.選擇恰當?shù)慕?shù)不僅有利于加快模型的運算速度,而且會提高模型的精度和預測能力.以相關(guān)系數(shù)(R)和交叉驗證均方差(RMSECV)為評價指標,比較了不同波數(shù)范圍和光譜預處理方法對模型的影響,確立了總氨基酸、芍藥苷和水分含量NIR多元校正模型的建模參數(shù).模型初步建立后,通過TQAnalyst提供的Leverage診斷功能剔除奇異點,應用交叉驗證法對模型逐步優(yōu)化,進而確定建模的最佳主因子數(shù).三個組分的建模參數(shù)見表2.優(yōu)化了建模參數(shù)后,用PLS法分別建立了測定同仁烏雞白鳳丸中總氨基酸、芍藥苷和水分含量的NIR校正模型.經(jīng)內(nèi)部交叉驗證,預測值與實測值之間有較好的相關(guān)性,見圖7.各模型的預測范圍、相關(guān)系數(shù)(correlationcoefficient,R)、校正均方差(rootmeansquareerrorofcalibration,RMSEC)、交叉驗證均方差(RMSECV)等評價指標見表3.2.5.3天麻雞白鳳丸的近紅外數(shù)學模型為了檢驗以上建立的近紅外模型的預測精度,隨機選出10份樣品組成驗證集,對其相應化學成分進行了預測,各