近紅外光譜對(duì)大同烏梅白鳳丸的定性和定量分析

近紅外光譜對(duì)大同烏梅白鳳丸的定性和定量分析

熱價(jià)分析方法的應(yīng)用同一烏江白鳳丸由20多種中藥組成。它是北京同益有限公司生產(chǎn)的國(guó)家秘密品種。它具有益血健康、調(diào)經(jīng)止血的功效，用于氣血兩虛引起的月經(jīng)不調(diào)。由于同一陰陽(yáng)白鳳丸與其他制造商生產(chǎn)的飼料差異，因此對(duì)其進(jìn)行了區(qū)分和分析。另一方面，目前，對(duì)雞冠花貝氏藥物含量的測(cè)定主要是高效液相色譜法和薄面掃描法。這些方法需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理和長(zhǎng)期的分析時(shí)間，不適用于工業(yè)現(xiàn)場(chǎng)的快速樣品分析。近紅外光譜技術(shù)操作簡(jiǎn)單、快速、不會(huì)破壞樣品，可以在電子控制方面無(wú)法實(shí)現(xiàn)，因此在石化、農(nóng)業(yè)、制藥等領(lǐng)域進(jìn)行了應(yīng)用。近年來(lái)，近紅外光譜在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。這顯示出很大的潛力。然而，由于中藥成分復(fù)雜，療效多，療效低，因此對(duì)近紅外光譜的吸收和重復(fù)性不足，因此對(duì)中藥的近紅外光譜分析報(bào)道甚少。許多樣品是在實(shí)驗(yàn)室中模擬的，因此很難包含實(shí)際生產(chǎn)工具的所有信息。在一般方法中，不存在關(guān)于中醫(yī)藥藥物等的詳細(xì)紅外分析報(bào)道。實(shí)驗(yàn)采用近紅外漫反射光譜法結(jié)合判別分析、相似度匹配和偏最小二乘回歸算法,對(duì)同仁烏雞白鳳丸和25個(gè)廠家的烏雞白鳳丸進(jìn)行了鑒別,并建立了同仁烏雞白鳳丸中總氨基酸、芍藥苷和水分含量的定量分析模型.結(jié)果表明,該方法快速、無(wú)損、準(zhǔn)確、可靠,可推廣用于此類樣品生產(chǎn)過(guò)程的定性和定量原位檢測(cè).1實(shí)驗(yàn)方法1.1儀器、試劑和藥物1.1.1儀器、檢測(cè)方法Waters2695液相色譜系統(tǒng),Waters2996PDA檢測(cè)器,Empower色譜工作站,日立L-8500氨基酸自動(dòng)分析儀,FW100型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司),METTLERAE240電子天平,KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),NicoletAntaris傅里葉變換近紅外光譜儀(ThermoNicolet),配置漫反射積分球附件、Result操作系統(tǒng)與TQAnalystV6分析軟件.1.1.2試劑與儀器色譜純甲醇(Merck公司),分析純甲醇、乙醇、鹽酸(北京化學(xué)試劑公司),氨基酸分析儀用緩沖液和顯色劑(和光純藥工業(yè)株式會(huì)社),水為重蒸餾水.1.1.3熱價(jià)下工藝生產(chǎn)芍藥苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,氨基酸對(duì)照品購(gòu)于味之素公司,同仁烏雞白鳳丸98批,北京白鳳丸15批,白鳳丸22批,由北京同仁堂股份有限公司北京同仁堂制藥廠提供,24個(gè)廠家的36批烏雞白鳳丸購(gòu)于藥店.以上樣品均為水蜜丸,除同仁烏雞白鳳丸按衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-3185-98項(xiàng)下工藝生產(chǎn)外,其余均按2005版中國(guó)藥典Ⅰ部烏雞白鳳丸項(xiàng)下工藝生產(chǎn).1.2近紅外光譜.取水蜜丸裝滿容積約為25ml的可旋轉(zhuǎn)樣品杯,利用儀器的積分球漫反射采樣系統(tǒng)采集樣品的近紅外光譜.光譜采集條件:以儀器內(nèi)置背景為參比,波數(shù)范圍3800～10000cm-1,掃描次數(shù)50次,分辨率8cm-1.1.3樣品含量與分析方法建立NIR定量模型需要參比方法測(cè)定樣品的化學(xué)值.采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定樣品中23種氨基酸含量,加和得總氨基酸含量.采用高效液相法測(cè)定芍藥苷含量,色譜條件為:C18柱(250mm×4.6mm,5μm),流動(dòng)相為甲醇-水(30:70),流速1ml·min-1,檢測(cè)波長(zhǎng)232nm.采用干燥失重法測(cè)定了含水量.為擴(kuò)大模型的適用范圍,制備了不同含水量的樣品,將樣品放入105℃烘箱中干燥0.5～8h,在不同的時(shí)間取樣獲取低水分的樣品;將樣品放入裝有飽和KNO3溶液的干燥器中密封0.5～6d,在不同的時(shí)間取樣獲取高水分的樣品.樣品各化學(xué)值的濃度分布情況如表1.2結(jié)果和討論2.1近紅外光譜數(shù)據(jù)處理同仁烏雞白鳳丸(1)和各廠家烏雞白鳳丸的NIR原始光譜見圖1.從原始近紅外光譜圖中很難直接鑒別同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸,一方面是由于中成藥成分眾多,組成復(fù)雜,因此難以從原始近紅外光譜中找出特定的吸收譜帶對(duì)其加以區(qū)分;另一方面是由于同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸的主要原料藥材和輔料均相同,這些相同成分的吸收峰往往掩蓋了代表特征信息成分的吸收峰,使得其NIRS圖非常相似,不能簡(jiǎn)單以峰位、峰形鑒別法進(jìn)行分類,必須經(jīng)過(guò)數(shù)學(xué)處理,提取到特征信息進(jìn)行分類鑒別.為減小實(shí)驗(yàn)過(guò)程中樣品顆粒尺寸、均勻性等因素對(duì)近紅外光譜的影響,采用多重散射校正技術(shù)(MultiplicativeScatterCorrection,MSC)對(duì)原始近紅外光譜進(jìn)行處理.光譜基線的漂移則通過(guò)微分處理加以校正.一階微分處理可以消除常數(shù)背景,二階微分可以消除線性背景.圖2～3分別為依次經(jīng)MSC、Norris導(dǎo)數(shù)平滑濾波和一、二階微分處理后得到的光譜圖,從中可以看出,近紅外光譜在經(jīng)MSC和微分處理后,不僅可以較好地消除基線偏移,還可以更為細(xì)致地反映樣品的光譜特征.在對(duì)光譜數(shù)據(jù)作微分處理時(shí),由于噪聲信號(hào)也被放大,因此通常在微分之前需要對(duì)光譜數(shù)據(jù)作平滑處理.2.2天麻雞白鳳丸和天麻白鳳丸的主成分分析主成分分析是將原變量進(jìn)行變換,用數(shù)目較少的新變量代替原變量,且新變量能最大限度地表征原變量的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)特征,同時(shí)去除無(wú)用信息.原始光譜數(shù)據(jù)經(jīng)MSC、Norris導(dǎo)數(shù)平滑和一階微分處理后,對(duì)其進(jìn)行主成分分析,前3個(gè)主成分代表了98.17%的信息.以前3個(gè)主成分得分析作圖,如圖4.從圖中可以看出,同仁烏雞白鳳丸在主成分特征空間上的分布較為集中,烏雞白鳳丸因來(lái)自多個(gè)廠家,分布較為分散.類別之間存在交叉,故直接采用主成分分析法難以準(zhǔn)確地對(duì)同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸進(jìn)行鑒別.2.3區(qū)分分析2.3.1方法的應(yīng)用.主成分分析-馬式距離法.對(duì)于是否正確處理主成分分析和發(fā)現(xiàn)的一個(gè)樣品,其重點(diǎn)在于用主成分分析-馬式距離法進(jìn)行判別分析,并將樣品分為主成分分析和發(fā)現(xiàn)判別分析法是常用的化學(xué)計(jì)量學(xué)定性方法,其基本思想是根據(jù)已知樣品集特征,選定適合的判別準(zhǔn)則,建立定性分析模型,最后用于預(yù)測(cè)未知樣品.在各種判別分析方法中,主成分分析-馬式距離法是一種較為實(shí)用的方法.當(dāng)用本方法分析一個(gè)未知樣品時(shí),軟件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)光譜進(jìn)行主成分分析,用標(biāo)準(zhǔn)光譜主成分分析的結(jié)果來(lái)確定未知樣品的得分值,得分圖用來(lái)計(jì)算樣品到每個(gè)類別的馬式距離,距離的值越接近于零,該樣品與標(biāo)準(zhǔn)光譜越相似.實(shí)際分析過(guò)程中,當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)光譜不止一類,未知樣品被判為與之馬式距離最短的那一類.實(shí)驗(yàn)采用主成分分析-馬式距離法進(jìn)行判別分析.2.3.2判別分類模型的建立及驗(yàn)證隨機(jī)選取同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸樣品各10份組成驗(yàn)證集,其余樣品組成校正集.實(shí)驗(yàn)中比較研究了三種預(yù)處理方法(不經(jīng)處理;依次經(jīng)MSC、Norris導(dǎo)數(shù)平滑和一階微分處理;依次經(jīng)MSC、Norris導(dǎo)數(shù)平滑和二階微分處理)處理后的光譜在不同波數(shù)范圍內(nèi)選用不同的主成分?jǐn)?shù)建立的判別分析模型的分析結(jié)果,在波數(shù)范圍為6500～8000cm-1的區(qū)間,經(jīng)MSC、Norris導(dǎo)數(shù)平滑和一階微分處理,主成分?jǐn)?shù)為35時(shí)建立的模型最佳,誤判數(shù)為0.而采用原始光譜和二階微分處理后誤判數(shù)分別為19和12.經(jīng)優(yōu)化參數(shù)后最終應(yīng)用主成分分析-馬式距離法建立了同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸的判別分類模型,取得了較好的效果,模型分類結(jié)果見圖5,由圖可直觀地看出,樣品明顯聚為兩類.用此模型對(duì)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行判別,均獲得了正確的分類.2.4相似度分析2.4.1gram-schmidt分析相似度匹配方法通過(guò)比較未知樣品與已知標(biāo)準(zhǔn)光譜在某個(gè)或多個(gè)波段的光譜信息,得到樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的匹配程度.該算法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)光譜進(jìn)行Gram-Schmidt分析,得到的正交模型代表了所有標(biāo)準(zhǔn)光譜中全部數(shù)據(jù)點(diǎn)提供的光譜信息.在對(duì)樣品進(jìn)行分析時(shí),使用Gram-Schmidt模型將樣品光譜中該模型包含的所有光譜信息去除得到樣品的殘差光譜.最后,將樣品光譜同其殘差光譜相比較得到“相似度”.相似度的范圍為0～100,其值越高,說(shuō)明未知樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的光譜越相似.2.4.2預(yù)處理方法的選擇以70批同仁烏雞白鳳丸作為標(biāo)準(zhǔn)樣品組成校正集,建立了相似度計(jì)算模型,將其用于計(jì)算其余28批同仁烏雞白鳳丸及58批烏雞白鳳丸的相似度.由于中成藥組成復(fù)雜,為充分利用其光譜信息,因此選擇全譜范圍(3800～10000cm-1)進(jìn)行建模.實(shí)驗(yàn)中比較研究了三種預(yù)處理方法(不經(jīng)處理;依次經(jīng)MSC、Norris導(dǎo)數(shù)平滑和一階微分處理;依次經(jīng)MSC、Norris導(dǎo)數(shù)平滑和二階微分處理)處理后的光譜所建立的模型對(duì)樣品的分析結(jié)果,結(jié)果以第三種預(yù)處理方法處理后的光譜建立的模型可以最為細(xì)致地反映不同樣品的差別.而采用原始光譜和一階微分光譜進(jìn)行預(yù)處理建立模型,計(jì)算得到的同仁烏雞白鳳丸與烏雞白鳳丸相似度沒(méi)有明顯的閾值.2.4.3天麻雞白鳳丸和天麻白鳳丸的比較將未參與建庫(kù)的樣品的近紅外光譜輸入前述所建立的模型,計(jì)算其與標(biāo)準(zhǔn)樣品的相似度,見圖6.所有樣品的相似度最小值為29.81,最大值為99.79.同仁烏雞白鳳丸相似度范圍為99.10～99.79,同仁堂制藥廠生產(chǎn)的烏雞白鳳丸相似度范圍為97.90～98.79,其他廠家生產(chǎn)的烏雞白鳳丸相似度范圍為29.81～97.85,表明該方法能反映不同產(chǎn)品的差別,可以將同仁烏雞白鳳丸和烏雞白鳳丸區(qū)分開來(lái).將域值設(shè)定為99.00,一旦未知樣品光譜相似度超過(guò)此值,該樣品被認(rèn)定為同仁烏雞白鳳丸.2.5定量分析2.5.1主因子數(shù)的選擇偏最小二乘法(partialleastsquare,PLS)是近紅外光譜分析中使用較多、效果較好的一種多變量校正方法,通過(guò)對(duì)變量系統(tǒng)中信息中心進(jìn)行綜合篩選,從中選取若干個(gè)對(duì)系統(tǒng)具有最佳解釋能力的新綜合變量進(jìn)行回歸建模.在PLS建模過(guò)程中,主因子數(shù)的選擇是優(yōu)化模型的關(guān)鍵步驟.如果建立模型時(shí)使用的主因子數(shù)過(guò)少,就不能反映未知樣品被測(cè)組分產(chǎn)生的光譜變化,其模型預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度就會(huì)降低,這種情況稱為不充分?jǐn)M合;如果使用過(guò)多的主因子建立模型,就會(huì)將一些代表噪音的主成分加到模型中,使模型的預(yù)測(cè)能力下降,這種情況稱為過(guò)度擬合.為充分提高光譜信號(hào)的有效信息利用率,同時(shí)避免出現(xiàn)“過(guò)擬合”現(xiàn)象,需要對(duì)主因子數(shù)進(jìn)行合理選擇.可采用內(nèi)部交叉驗(yàn)證法,考察主因子數(shù)對(duì)交叉驗(yàn)證均方差(rootmeansquareerrorofcrossvalidation,RMSECV)的影響,選取RMSECV最小時(shí)的主因子數(shù)建模.2.5.2仁雞白鳳丸的多元校正模型譜區(qū)范圍、預(yù)處理方法和主因子數(shù)的選擇是決定所構(gòu)建的近紅外模型質(zhì)量高低的關(guān)鍵因素.選擇恰當(dāng)?shù)慕?shù)不僅有利于加快模型的運(yùn)算速度,而且會(huì)提高模型的精度和預(yù)測(cè)能力.以相關(guān)系數(shù)(R)和交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)為評(píng)價(jià)指標(biāo),比較了不同波數(shù)范圍和光譜預(yù)處理方法對(duì)模型的影響,確立了總氨基酸、芍藥苷和水分含量NIR多元校正模型的建模參數(shù).模型初步建立后,通過(guò)TQAnalyst提供的Leverage診斷功能剔除奇異點(diǎn),應(yīng)用交叉驗(yàn)證法對(duì)模型逐步優(yōu)化,進(jìn)而確定建模的最佳主因子數(shù).三個(gè)組分的建模參數(shù)見表2.優(yōu)化了建模參數(shù)后,用PLS法分別建立了測(cè)定同仁烏雞白鳳丸中總氨基酸、芍藥苷和水分含量的NIR校正模型.經(jīng)內(nèi)部交叉驗(yàn)證,預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有較好的相關(guān)性,見圖7.各模型的預(yù)測(cè)范圍、相關(guān)系數(shù)(correlationcoefficient,R)、校正均方差(rootmeansquareerrorofcalibration,RMSEC)、交叉驗(yàn)證均方差(RMSECV)等評(píng)價(jià)指標(biāo)見表3.2.5.3天麻雞白鳳丸的近紅外數(shù)學(xué)模型為了檢驗(yàn)以上建立的近紅外模型的預(yù)測(cè)精度,隨機(jī)選出10份樣品組成驗(yàn)證集,對(duì)其相應(yīng)化學(xué)成分進(jìn)行了預(yù)測(cè),各