25味中藥對小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響

25味中藥對小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（ra）是一種非均質(zhì)性炎癥性疾病。這種發(fā)病機制與t淋巴結(jié)和b細胞激活有關(guān)，分泌大量免疫球蛋白并產(chǎn)生免疫反應(yīng)。因此，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物治療應(yīng)采用抗炎、抗抑制劑的藥物治療，以取得一定的療效。本研究選擇25味具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)及改善微循環(huán)功能的單味中藥,刺激Ⅱ型膠原纖維誘導(dǎo)的小鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎脾臟淋巴細胞,根據(jù)淋巴細胞增殖反應(yīng)的結(jié)果,初步分析25味中藥的作用效果。1材料表面1.1動物1.2藥品制品鑒定標準中藥對照品:防風(fēng)、麝香、當(dāng)歸、天麻、丹參、牛膝、白芍、獨活、黃芪、人參、川芎、黨參、全蝎、羌活、地黃、柴胡、威靈仙、羚羊角、水蛭、蟾蜍、地龍、牛膽粉、紫杉醇、高三尖杉堿、蛇膽汁等,均購自中國藥品生物制品鑒定所。制備:取上述中藥對照品0.5g(麝香0.01g),加蒸餾水40mL,浸泡20min后加熱煮沸,濃縮至10mL,反復(fù)過濾,去藥渣,得2mL澄明溶液,藥液終濃度為250μg·μL-1(麝香終濃度為50μg·μL-1).放4℃冰箱保存。1.3試劑和藥品Ⅱ型膠原纖維(bovinetypeⅡcollagen):Sigma公司產(chǎn)品;福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑,Gibco公司產(chǎn)品;胎牛血清,杭州四季清公司;MTT,上海生物工程公司分裝;SodiumDedecySuLfate(SDS):上海生物工程公司;倒置相差顯微鏡(德國Olympus公司);Model1550全自動酶標儀(德國BIO-RAD)。2方法2.1免疫組采用100g型膠原纖維和不完全佐劑小鼠初次免疫為腹部sc100μgⅡ型膠原纖維和100μL福氏完全佐劑,3周后再次免疫,使用100μgⅡ型膠原纖維和100μL福氏不完全佐劑;小鼠初次免疫后第5周,脫頸處死,無菌摘除脾臟。2.2細胞懸液的制備無菌摘除的小鼠脾臟在生理鹽水中漂洗2次,去除表面的殘留血液,剪碎,無菌擠壓過200目網(wǎng),同時用NH4Cl2mL沖洗,去除紅細胞,離心1500r·min-110min,去上清,加2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,用0.5%的臺盼藍染色計數(shù),制成2×105個/mL的細胞懸液。2.3mtt法對脾淋巴結(jié)的克隆2.3.1中藥提取液和mtt液的制備取96孔細胞培養(yǎng)板,每孔加0.1mLPBS含0.5μgⅡ型膠原纖維,-4℃保存12h。吸去板中液體,每孔用200μL含0.05%Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加0.1mL脾臟淋巴細胞的培養(yǎng)液,6h后每孔加入2μL的中藥提取液進行刺激,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。吸去培養(yǎng)液,每孔加0.1mLPBS和10μLMTT溶液(5mg·mL-1),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。每孔加0.1mL10%SDS(含10mmol·L-1鹽酸),置酶聯(lián)檢測儀中測定吸光度(A)值,檢測波長570nm,參考波長630nm。設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)液、MTT、SDS),陰性對照孔(細胞、培養(yǎng)液、MTT、SDS),中藥刺激孔(中藥提取液、細胞、培養(yǎng)液、MTT、SDS),每組設(shè)定6復(fù)孔。2.3.2%co培養(yǎng)箱取96孔細胞培養(yǎng)板,每孔直接加0.1mL脾臟淋巴細胞的培養(yǎng)液,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。每孔加入2μL的中藥提取液進行刺激,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,吸去培養(yǎng)液,每孔加0.1mLPBS和10μLMTT溶液(5mg·mL-1),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,余下操作步驟同上。2.3.3統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)以表示,應(yīng)用SPSS17.0軟件進行分析,中藥刺激孔與陰性對照孔的A值采用配對樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。3結(jié)果3.1陰性對照組和陰性對照組的為抑制,其為促進,二者的為促進,二者的為促進,二者的為促進,二者的為促進,其復(fù)合化的方法為25味中藥提取液刺激脾臟淋巴細胞,酶聯(lián)檢測A如表1。中藥刺激孔A值與陰性對照孔A進行比較,小于陰性對照組的為抑制,大于陰性對照組的為促進。根據(jù)A的大小將促進程度分為輕微(0.066~0.200)、中等(0.200~0.400)、較強(>0.400),結(jié)果表明,羌活對淋巴細胞增殖具有明顯的抑制作用,而川芎、全蝎、丹參則具有較強的促進作用,結(jié)果詳見表2。3.2中藥作用結(jié)果在中藥刺激后培養(yǎng)時間明顯增長,需要72h,而且加入MTT溶液后的培養(yǎng)時間也要延長2h。酶聯(lián)檢測A如表3。中藥刺激孔A與陰性對照孔A值進行比較,小于陰性對照組的為抑制,大于陰性對照組的為促進,根據(jù)A的大小將促進分為輕微(0.016~0.500)、中等(0.500~1.000)、較強(>1.000),結(jié)果麝香、白芍、羌活、牛膝對淋巴細胞增殖反應(yīng)具有明顯的抑制作用,而川芎、水蛭、地龍則具有較強的促進作用,其余中藥作用結(jié)果詳見表4。4在條件方面的作用類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種需要長期用藥治療的慢性疾病,中藥治療具有一定的療效,可能與中藥的抗炎、免疫調(diào)節(jié)及改善微循環(huán)功能有關(guān),本研究利用Ⅱ型膠原纖維誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎動物模型,選擇25味中藥刺激脾臟淋巴細胞,觀察其對淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響程度。實驗結(jié)果表明:在Ⅱ型膠原纖維存在條件下,羌活對淋巴細胞增殖具有明顯抑制作用,而川芎、全蝎、丹參則有較強促進作用,其余中藥具有輕微或者中等程度促進作用;在無Ⅱ型膠原纖維存在條件下,麝香、白芍、羌活、牛膝對淋巴細胞增殖反應(yīng)具有明顯抑制作用,川芎、水蛭、地龍則具有較強促進作用,其余中藥表現(xiàn)為輕微或者中等程度促進作用;在這兩種條件下大部分單味中藥對淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響程度基本相同,說明它們的作用途徑可能類似,少部分單味中藥在不同條件下對淋巴細胞增殖反應(yīng)的影響程度有強、弱之分,有待進一步研究。羌活、川芎未受條件影響表現(xiàn)出明顯的抑制和促進作用,這與現(xiàn)代藥理研