25味中藥對小鼠類風濕性關節(jié)炎淋巴細胞增殖反應的影響

25味中藥對小鼠類風濕性關節(jié)炎淋巴細胞增殖反應的影響

類風濕性關節(jié)炎（ra）是一種非均質性炎癥性疾病。這種發(fā)病機制與t淋巴結和b細胞激活有關，分泌大量免疫球蛋白并產生免疫反應。因此，類風濕性關節(jié)炎的藥物治療應采用抗炎、抗抑制劑的藥物治療，以取得一定的療效。本研究選擇25味具有抗炎、免疫調節(jié)及改善微循環(huán)功能的單味中藥,刺激Ⅱ型膠原纖維誘導的小鼠類風濕性關節(jié)炎脾臟淋巴細胞,根據淋巴細胞增殖反應的結果,初步分析25味中藥的作用效果。1材料表面1.1動物1.2藥品制品鑒定標準中藥對照品:防風、麝香、當歸、天麻、丹參、牛膝、白芍、獨活、黃芪、人參、川芎、黨參、全蝎、羌活、地黃、柴胡、威靈仙、羚羊角、水蛭、蟾蜍、地龍、牛膽粉、紫杉醇、高三尖杉堿、蛇膽汁等,均購自中國藥品生物制品鑒定所。制備:取上述中藥對照品0.5g(麝香0.01g),加蒸餾水40mL,浸泡20min后加熱煮沸,濃縮至10mL,反復過濾,去藥渣,得2mL澄明溶液,藥液終濃度為250μg·μL-1(麝香終濃度為50μg·μL-1).放4℃冰箱保存。1.3試劑和藥品Ⅱ型膠原纖維(bovinetypeⅡcollagen):Sigma公司產品;福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑,Gibco公司產品;胎牛血清,杭州四季清公司;MTT,上海生物工程公司分裝;SodiumDedecySuLfate(SDS):上海生物工程公司;倒置相差顯微鏡(德國Olympus公司);Model1550全自動酶標儀(德國BIO-RAD)。2方法2.1免疫組采用100g型膠原纖維和不完全佐劑小鼠初次免疫為腹部sc100μgⅡ型膠原纖維和100μL福氏完全佐劑,3周后再次免疫,使用100μgⅡ型膠原纖維和100μL福氏不完全佐劑;小鼠初次免疫后第5周,脫頸處死,無菌摘除脾臟。2.2細胞懸液的制備無菌摘除的小鼠脾臟在生理鹽水中漂洗2次,去除表面的殘留血液,剪碎,無菌擠壓過200目網,同時用NH4Cl2mL沖洗,去除紅細胞,離心1500r·min-110min,去上清,加2mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,用0.5%的臺盼藍染色計數,制成2×105個/mL的細胞懸液。2.3mtt法對脾淋巴結的克隆2.3.1中藥提取液和mtt液的制備取96孔細胞培養(yǎng)板,每孔加0.1mLPBS含0.5μgⅡ型膠原纖維,-4℃保存12h。吸去板中液體,每孔用200μL含0.05%Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加0.1mL脾臟淋巴細胞的培養(yǎng)液,6h后每孔加入2μL的中藥提取液進行刺激,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。吸去培養(yǎng)液,每孔加0.1mLPBS和10μLMTT溶液(5mg·mL-1),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2h。每孔加0.1mL10%SDS(含10mmol·L-1鹽酸),置酶聯檢測儀中測定吸光度(A)值,檢測波長570nm,參考波長630nm。設置調零孔(培養(yǎng)液、MTT、SDS),陰性對照孔(細胞、培養(yǎng)液、MTT、SDS),中藥刺激孔(中藥提取液、細胞、培養(yǎng)液、MTT、SDS),每組設定6復孔。2.3.2%co培養(yǎng)箱取96孔細胞培養(yǎng)板,每孔直接加0.1mL脾臟淋巴細胞的培養(yǎng)液,在37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。每孔加入2μL的中藥提取液進行刺激,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h,吸去培養(yǎng)液,每孔加0.1mLPBS和10μLMTT溶液(5mg·mL-1),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,余下操作步驟同上。2.3.3統(tǒng)計分析數據以表示,應用SPSS17.0軟件進行分析,中藥刺激孔與陰性對照孔的A值采用配對樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。3結果3.1陰性對照組和陰性對照組的為抑制,其為促進,二者的為促進,二者的為促進,二者的為促進,二者的為促進,其復合化的方法為25味中藥提取液刺激脾臟淋巴細胞,酶聯檢測A如表1。中藥刺激孔A值與陰性對照孔A進行比較,小于陰性對照組的為抑制,大于陰性對照組的為促進。根據A的大小將促進程度分為輕微(0.066~0.200)、中等(0.200~0.400)、較強(>0.400),結果表明,羌活對淋巴細胞增殖具有明顯的抑制作用,而川芎、全蝎、丹參則具有較強的促進作用,結果詳見表2。3.2中藥作用結果在中藥刺激后培養(yǎng)時間明顯增長,需要72h,而且加入MTT溶液后的培養(yǎng)時間也要延長2h。酶聯檢測A如表3。中藥刺激孔A與陰性對照孔A值進行比較,小于陰性對照組的為抑制,大于陰性對照組的為促進,根據A的大小將促進分為輕微(0.016~0.500)、中等(0.500~1.000)、較強(>1.000),結果麝香、白芍、羌活、牛膝對淋巴細胞增殖反應具有明顯的抑制作用,而川芎、水蛭、地龍則具有較強的促進作用,其余中藥作用結果詳見表4。4在條件方面的作用類風濕性關節(jié)炎是一種需要長期用藥治療的慢性疾病,中藥治療具有一定的療效,可能與中藥的抗炎、免疫調節(jié)及改善微循環(huán)功能有關,本研究利用Ⅱ型膠原纖維誘導的小鼠關節(jié)炎動物模型,選擇25味中藥刺激脾臟淋巴細胞,觀察其對淋巴細胞增殖反應的影響程度。實驗結果表明:在Ⅱ型膠原纖維存在條件下,羌活對淋巴細胞增殖具有明顯抑制作用,而川芎、全蝎、丹參則有較強促進作用,其余中藥具有輕微或者中等程度促進作用;在無Ⅱ型膠原纖維存在條件下,麝香、白芍、羌活、牛膝對淋巴細胞增殖反應具有明顯抑制作用,川芎、水蛭、地龍則具有較強促進作用,其余中藥表現為輕微或者中等程度促進作用;在這兩種條件下大部分單味中藥對淋巴細胞增殖反應的影響程度基本相同,說明它們的作用途徑可能類似,少部分單味中藥在不同條件下對淋巴細胞增殖反應的影響程度有強、弱之分,有待進一步研究。羌活、川芎未受條件影響表現出明顯的抑制和促進作用,這與現代藥理研