小半夏加茯苓湯高效液相色譜條件考察及復(fù)方止嘔效用成分的特征圖譜方法學(xué)研究

小半夏加茯苓湯高效液相色譜條件考察及復(fù)方止嘔效用成分的特征圖譜方法學(xué)研究

東漢著名藝術(shù)家張仲景創(chuàng)造的“缺錢”。千百年來(lái),該方被廣泛用于治療各種原因引起的嘔吐,療效顯著。研究還表明復(fù)方小半夏加茯苓湯具有抑制肝癌、胃癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。近期研究發(fā)現(xiàn)家鴿嘔吐潛伏期、嘔吐次數(shù)與總生物堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈良好線性關(guān)系,且相關(guān)性極顯著。單味藥藥效研究表明:半夏中總生物堿及鳥苷具有止嘔藥效;生姜中姜酚類成分6-Gingerol(6-姜酚)、8-Gingerol(8-姜酚)和10-Gingerol(10-姜酚)為其止嘔藥用主要成分;茯苓中茯苓三萜類成分茯苓酸及去氫茯苓酸具有止嘔藥效。單味藥效成分的分析方法已有較多的研究,而復(fù)方效用物質(zhì)基礎(chǔ)研究,特別是復(fù)方藥效成分譜效關(guān)系研究很少文獻(xiàn)報(bào)道。我們的工作主要是利用高效液相色譜儀(HPLC)分析手段,建立復(fù)方小半夏加茯苓湯藥效成分的特征圖譜,以期為中藥復(fù)方HPLC圖譜與止嘔藥效關(guān)系的研究提供理論基礎(chǔ)。1實(shí)驗(yàn)材料1.1儀器、藥品、儀器高效液相色譜儀(ShimadzuLC-20AT);二元泵,二極管陣列檢測(cè)器(PDA);色譜工作站(Lc-solution);AG135型電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;水浴鍋;SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵;CH-250型超聲波清洗機(jī)(天津恒奧科技公司,功率250W,頻率33kHz)。鳥苷、鹽酸麻黃堿(中國(guó)藥品生物制品檢定所);6-姜酚、10-姜酚(天津馬克生物技術(shù)有限公司);8-姜酚(天津化標(biāo)生物技術(shù)有限公司);蘆丁、茯苓酸、去氫茯苓酸(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司);色譜乙腈、色譜甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);水(樂百氏純凈水);磷酸(優(yōu)級(jí))。1.2實(shí)驗(yàn)材料生半夏購(gòu)于貴州赫章縣半夏生產(chǎn)基地,生姜購(gòu)于貴州長(zhǎng)順縣生姜生產(chǎn)基地,茯苓購(gòu)于貴陽(yáng)市花果園藥材批發(fā)市場(chǎng)。1.3樣品的制備1.3.1去氫茯苓酸溶液配制精密稱取鳥苷、鹽酸麻黃堿、蘆丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、茯苓酸及去氫茯苓酸適量用色譜甲醇定容,制成1.00mg/mL鳥苷、3.57mg/mL鹽酸麻黃堿、1.00mg/mL蘆丁、1.00mg/mL6-姜酚、1.00mg/mL8-姜酚、1.00mg/mL、10-姜酚、1.13mg/mL茯苓酸、1.13mg/mL去氫茯苓酸儲(chǔ)備液。1.3.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制分別移取鹽酸麻黃堿1mL,6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、鳥苷、茯苓酸及去氫茯苓酸各0.5mL,蘆丁0.25mL到5mL的容量瓶中用甲醇稀釋到刻度,制成含鳥苷0.10mg/mL、6-姜酚0.10mg/mL、8-姜酚0.10mg/mL、10-姜酚0.10mg/mL、茯苓酸0.11mg/mL、去氫茯苓酸0.11mg/mL、含麻黃堿0.71mg/mL、蘆丁0.05mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。1.3.3乙醇提取物的制備取生半夏6g,茯苓3g,另將生姜切碎,稱取5g,置于500mL圓底燒瓶中,加入8倍量的50%乙醇(112mL)于85℃水浴鍋中提取,溶劑沸騰開始計(jì)時(shí),提取2h,過濾;殘?jiān)偌尤?倍量50%乙醇同條件提取,過濾,合并兩次濾液,搖勻,用微孔濾膜過濾,備用。2方法與討論2.1復(fù)方提取、制備及核心樣品測(cè)定8種檢測(cè)成分中,鳥苷、麻黃堿、蘆丁易溶于水,姜酚、茯苓酸及去氫茯苓酸脂溶性較大,為使復(fù)方提取液HPLC圖譜中各成分響應(yīng)值較均勻,考察了復(fù)方水提、50%乙醇提取及95%乙醇提取三者之間圖譜差異(圖1),并得出3種提取方法中8種止嘔效用成分含量(表1)。2.2色度條件的選擇2.2.1色譜柱對(duì)復(fù)方分離的影響為使復(fù)方8種效用成分達(dá)到較佳分離效果,考察了DiamonsilC8、DiamonsilC18、ShimadzuC18、PhenomenexC184種色譜柱對(duì)復(fù)方分離的變化(表2所示)。樣品為50%醇提復(fù)方;236nm檢測(cè)波長(zhǎng);40℃柱溫;流動(dòng)相A相為乙腈,B相為0.1%磷酸水,0.01min→B相為99%,65min→B相為5%,75min→B相為0%,梯度洗脫,所得色譜圖如圖2所示。2.2.2洗脫流動(dòng)相0.1%為篩選較佳洗脫流動(dòng)相,分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水(0.1%)、乙腈-磷酸水(0.1%)、乙腈-甲酸水(0.1%)、乙腈-三乙胺水(0.02%)6種洗脫流動(dòng)相。樣品為50%醇提復(fù)方;色譜條件為:PhenomenexC18色譜柱;236nm檢測(cè)波長(zhǎng);40℃柱溫;流動(dòng)相A相為有機(jī)相,0.01min→B相為99%,65min→B相為5%,75min→B相為0%,梯度洗脫,所得色譜圖如圖3所示。2.2.3種效用成分混合標(biāo)準(zhǔn)液的色譜圖8種效用成分中,鹽酸麻黃堿最大吸收波長(zhǎng)為206nm,去氫茯苓酸、茯苓酸最大吸收波長(zhǎng)為241nm,鳥苷、蘆丁最大吸收波長(zhǎng)為254nm,6-姜酚、8-姜酚及10-姜酚最大吸收波長(zhǎng)為280nm。為使色譜圖中8種成分響應(yīng)值基本均勻,試驗(yàn)考察了8種效用成分混合標(biāo)準(zhǔn)液在206nm、236nm、254nm及280nm4個(gè)波長(zhǎng)處的圖譜差異(圖3)。樣品為50%醇提復(fù)方;色譜條件為:PhenomenexC18色譜柱;40℃柱溫;流動(dòng)相A相為乙腈,B相為0.1%磷酸;洗脫梯度如表3所示。2.2.4色譜條件篩選提取條件篩選中,從不同提取方法的圖譜差異(圖1)及三種提取方法中8種效用成分含量比較(表1)可以看出:水提復(fù)方中,鳥苷、麻黃堿含量相對(duì)較高;95%乙醇提取復(fù)方姜酚類含量較高;50%乙醇提取復(fù)方中各成分含量較均勻。因此,綜合考慮各指標(biāo)成分的色譜考察條件,本試驗(yàn)選用50%乙醇提取作為復(fù)方提取溶劑。色譜柱的篩選,從四種色譜柱所分離色圖譜(圖2)可以看出:出峰數(shù)目、保留時(shí)間等均不一致,其中PhenomenexC18色譜柱相對(duì)來(lái)說有較好的分離效果,且能保證有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性,故選做分離復(fù)方所用色譜柱。洗脫流動(dòng)相篩選,從6種流動(dòng)相所分離復(fù)方色譜圖比較(圖3)可以看出:甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水(0.1%)所分離的復(fù)方圖譜均較良好,其中乙腈-磷酸水(0.1%)分離效果最佳,因此選擇乙腈-磷酸水(0.1%)系統(tǒng)作為復(fù)方洗脫流動(dòng)相。檢測(cè)波長(zhǎng)篩選,從混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在4個(gè)波長(zhǎng)處色譜圖的比較(圖4)顯示:在206nm處,因受流動(dòng)相影響,復(fù)方圖譜分離度較差;在280nm處,麻黃堿響應(yīng)值較低;254nm檢測(cè),姜酚類成分響應(yīng)值太低;236nm波長(zhǎng)檢測(cè),各對(duì)照峰之間響應(yīng)值較均勻,因此選擇波長(zhǎng)236nm作為復(fù)方檢測(cè)波長(zhǎng)。綜上所述,最終確定測(cè)定復(fù)方8種止嘔效用成分的色譜條件為:PhenomenexGeminiC18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相A相為乙腈,B相為0.1%磷酸水,洗脫梯度見表3;柱溫40℃;檢測(cè)波長(zhǎng)236nm;流速1mL/min。最終色譜圖譜如圖5所示。2.3方法研究2.3.1含鳥苷的0.0.ml,需要做什么?精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)液適量,用色譜甲醇稀釋,濃度分別為:(1)含鳥苷0.100mg/mL、6-姜酚0.100mg/mL、8-姜酚0.100mg/mL、10-姜酚0.100mg/mL、茯苓酸0.110mg/mL、去氫茯苓酸0.110mg/mL、麻黃堿0.710mg/mL、蘆丁0.050mg/mL;(2)含鳥苷0.050mg/mL、6-姜酚0.050mg/mL、8-姜酚0.050mg/mL、10-姜酚0.050mg/mL、茯苓酸0.055mg/mL、去氫茯苓酸0.055mg/mL、麻黃堿0.355mg/mL、蘆丁0.025mg/mL;(3)含鳥苷0.025mg/mL、6-姜酚0.025mg/mL、8-姜酚0.025mg/mL、10-姜酚0.025mg/mL、茯苓酸0.028mg/mL、去氫茯苓酸0.028mg/mL、麻黃堿0.178mg/mL、蘆丁0.013mg/mL;(4)含鳥苷0.013mg/mL、6-姜酚0.013mg/mL、8-姜酚0.013mg/mL、10-姜酚0.013mg/mL、茯苓酸0.013mg/mL、去氫茯苓酸0.014mg/mL、麻黃堿0.089mg/mL、蘆丁0.006mg/mL;(5)含鳥苷0.006mg/mL、6-姜酚0.006mg/mL、8-姜酚0.006mg/mL、10-姜酚0.006mg/mL、茯苓酸0.006mg/mL、去氫茯苓酸0.007mg/mL、麻黃堿0.045mg/mL、蘆丁0.003mg/mL;(6)含鳥苷0.003mg/mL、6-姜酚0.003mg/mL、8-姜酚0.003mg/mL、10-姜酚0.003mg/mL、茯苓酸0.003mg/mL、去氫茯苓酸0.004mg/mL、麻黃堿0.023g/mL、蘆丁0.002mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,以上系列標(biāo)準(zhǔn)溶液在2.2.4項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20μL,以峰面積積分值為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程及線性范圍見表4。2.3.2重復(fù)進(jìn)樣6次分別精密移取稀釋后的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,在2.2.4項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20μL,重復(fù)進(jìn)樣6次。鳥苷、鹽酸麻黃堿、蘆丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積積分值的RSD分別為0.79%、0.87%、0.61%、0.81%、0.65%、0.74%、0.54%、0.76%,表明儀器精密度良好(圖6)。2.3.3重復(fù)性試驗(yàn)ld分別按2.2項(xiàng)方法提取6份復(fù)方提取液,按5項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣20μL,鳥苷、鹽酸麻黃堿、蘆丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積積分值的RSD分別為0.65%、0.71%、0.90%、0.56%、0.49%、0.80%、0.90%、0.93%,表明試驗(yàn)重復(fù)性良好(圖7)。2.3.4去氫茯苓酸、去氫茯苓酸峰面積積分值rsd取同一供試溶液,分別于制樣后0,2,4,8,12,24h,按2.2.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣20μL,鳥苷、鹽酸麻黃堿、蘆丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、去氫茯苓酸、茯苓酸峰面積積分值的RSD分別為1.25%、0.96%、0.83%、1.04%、0.92%、1.07%、0.77%、0.82%,表明供試品溶液在24小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定(圖8)。2.3.5去氫茯苓酸、茯苓酸回收率分別取已知含量的同一個(gè)供試樣品9份,分為3組,每組精密加入高、中、低3個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按2.2.4項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣20μL,鳥苷、鹽酸麻黃堿、蘆丁、6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、去氫茯苓酸、茯苓酸回收率分別為:98.33%、97.26%、97.81%、96.60%、98.01%、97.09%、96.46%和95.90%;RSD分別為:1.0%、1.3%、1.1%、1.3%、1.3%、1.3%、1.0%和