酶免疫測(cè)定技術(shù)

酶免疫測(cè)定技術(shù)廣州醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科廖偉嬌概述1標(biāo)記免疫技術(shù)：將試劑抗原或試劑抗體用可以微量檢測(cè)的標(biāo)記物（例如放射性核素、熒光素、酶等）進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，不必測(cè)定抗原抗體復(fù)合物本身，而是測(cè)定復(fù)合物中的標(biāo)記物，這種免疫技術(shù)，稱為標(biāo)記免疫技術(shù)2標(biāo)記免疫技術(shù)的分類：⑴按標(biāo)記物分類：同位素標(biāo)記熒光素酶標(biāo)記等等⑵按檢測(cè)對(duì)象分類：免疫組織化學(xué)技術(shù)免疫測(cè)定技術(shù)酶免疫測(cè)定技術(shù)概述：1.酶免疫測(cè)定技術(shù)的概念：將試劑抗原或試劑抗體用酶進(jìn)行標(biāo)記，試劑與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測(cè)定復(fù)合物中的酶，這種免疫技術(shù)，稱為酶標(biāo)記免疫技術(shù)。2.分類：酶免疫組化酶免疫測(cè)定均相法異相法固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)定均相法：不需分離復(fù)合物與游離標(biāo)記物即可直接測(cè)定的方法。異相法則需分離后測(cè)定均相酶免疫測(cè)定：1.EMIT(酶擴(kuò)大免疫測(cè)定技術(shù)):2.克隆酶供體免疫測(cè)定：位阻EDEDEAEAEDAbAb活性酶標(biāo)本中Ag酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

第一節(jié)ELISA的原理和類型一、基本要求：1.使Ag(或Ab)結(jié)合到某種固相載體表面，并保持免疫活性。免疫吸附劑2.使Ag(或Ab)與某種酶結(jié)合，既保持免疫活性，又有酶的活性。酶結(jié)合物3.標(biāo)本、酶標(biāo)記物能按一定的次序與固相載體表面的Ag(或Ab)結(jié)合，加入酶的底物后能產(chǎn)生有色反應(yīng)。底物二、必備試劑：固相的Ag或Ab----免疫吸附劑酶標(biāo)記的Ab或Ag----結(jié)合物酶反應(yīng)的底物-------底物三、方法類型：夾心法間接法競(jìng)爭(zhēng)法捕獲法測(cè)IgM抗體標(biāo)本標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色有色為陽性顯色有色為陽性酶標(biāo)二抗底物3.競(jìng)爭(zhēng)法Ag※Ag※Ab+AbAg(標(biāo)本)(定量)AgAbEE終止液標(biāo)本酶標(biāo)抗體底物顯色顯色固相固相標(biāo)本酶標(biāo)二抗底物1.夾心法2.間接法

第二節(jié)ELISA的技術(shù)要點(diǎn)一、試劑制備㈠免疫吸附劑㈡酶標(biāo)記抗原或抗體二、反應(yīng)條件的選擇㈠酶標(biāo)二抗?jié)舛冗x擇㈡包被抗原濃度的選擇三、操作標(biāo)準(zhǔn)化一、試劑制備：㈠免疫吸附劑固相載體⑴要求：①吸附力強(qiáng)

②能保持Ag或Ab活性

③不參與化學(xué)反應(yīng)⑵載體性能比較①載體材料：+、-結(jié)果差別大②ELISA板：10ug/LIgG包被,加酶標(biāo)抗IgG，顯色后，測(cè)20孔的OD，要求CV<10%。⑶常用載體：材料：聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等形狀：小試管、小珠、微量反應(yīng)板2.Ag或Ab：純度高、效價(jià)高、結(jié)合力高3.免疫吸附劑(固相Ag或Ab)：⑴包被：將Ag或Ab固相化的過程包被緩沖液、包被方法⑵封閉：包被后在用1~5%小牛血清白蛋白再包被，以消除非特異吸附的干擾。㈡酶結(jié)合物：1.酶的要求：純度高、催化轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、標(biāo)記后穩(wěn)定。2.ELISA常用酶：HRP、AP、?-半乳糖苷酶等

3.酶的底物：HRP可溶性底物及呈色：鄰苯二胺(OPD)：橙紅(429nm)四甲基聯(lián)苯胺(TMB)：黃色(450nm)5-氨基水楊酸(5-ASA)：棕色(550nm)魯咪諾+H2O2：熒光HRP不可溶性底物及呈色：DAB(棕黃色)α-萘酚(紅色)，3-氧基-9-乙基卡唑(紅色)4-氯-1-萘酚(灰藍(lán)色)AP可溶性底物及呈色：對(duì)硝基苯磷酸酯(P-NPP)：黃色(405nm)4-甲基傘基磷酸酯(4-MuP)：熒光Ap不可溶性底物及呈色：NBT和BCIP混合液：紫色堅(jiān)固紅和萘酚ASMX混合液：紅色?-半乳糖苷酶：

4-甲基傘基-?-半乳糖苷：熒光4.酶結(jié)合物的制備：⑴戊二醛交聯(lián)法⑵過碘酸鹽氧化法二、反應(yīng)條件的選擇酶標(biāo)二抗?jié)舛龋?00ug/LIgG，加稀釋的酶標(biāo)二抗，取OD=0.8者。包被Ag或Ab濃度：棋盤滴定法3.溫度、時(shí)間等三、操作標(biāo)準(zhǔn)化1加樣2保溫3洗滌4比色

四、影響ELISA測(cè)定的因素：

試劑盒因素實(shí)驗(yàn)操作中的影響試劑盒因素：A固相材料：孔間不均B抗原或抗體：純化(天然但干擾多)、合成(多肽分子較小，常有空間位阻)和基因抗原(與片段的選擇和制備水平有關(guān))C酶結(jié)合物D色原底物：OPD:致Ca，不穩(wěn)定(避光)TMB：水溶性差(商品：配好)E運(yùn)輸儲(chǔ)存操作中的注意事項(xiàng)：1標(biāo)本的收集和保存試劑的準(zhǔn)備加樣溫育洗板顯色比色結(jié)果判斷樣品的收集和保存：1.溶血標(biāo)本可增加非特異性顯色(Hb作用于HRP的輔基)。2.細(xì)菌污染標(biāo)本因菌體內(nèi)源性酶而假“-”(破壞Ag或Ab)或假