肝素對肝星狀細(xì)胞增殖分泌的影響

肝素對肝星狀細(xì)胞增殖分泌的影響

異常的細(xì)胞外基質(zhì)（cem）的過度合成和積聚是肝纖維化發(fā)生和發(fā)展的主要病理過程。愈來愈多的證據(jù)表明,肝星狀細(xì)胞被激活、數(shù)量增多,分泌大量膠原等ECM是肝纖維化形成的主要機(jī)制。自2002年以來,我們觀察了肝素對肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞增殖及分泌的影響,旨在為肝纖維化的防治提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1試劑與儀器Wistar雄性大鼠(山東省衛(wèi)生防疫站提供),體重300～350g。四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、尼可登(Nycodenz),α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、層粘連蛋白(LN)一抗(北京中山生物制品有限公司,SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),層流超凈臺、水平離心機(jī)、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡、高壓蒸汽消毒裝置、酶標(biāo)儀。1.2肝纖維化大鼠的檢測普通桿狀飼料喂養(yǎng)大鼠,自由進(jìn)水,皮下注射40%CCl4花生油溶液(0.25ml/100g體重,首次加倍),每隔3d注射1次,共15次,即得肝纖維化大鼠。1.3mtt法測細(xì)胞生長應(yīng)用Nycodenz一步密度梯度離心法分離肝纖維化大鼠的肝星狀細(xì)胞。將純度90%以上的新分離的肝星狀細(xì)胞隨機(jī)分為A、B、C三組,均懸浮在DMEM培養(yǎng)基中,A、B組培養(yǎng)液中分別加入1000和2000μg/ml肝素,按1×104/ml接種在96孔培養(yǎng)板中,每孔200μl,準(zhǔn)備MTT法測細(xì)胞生長;另以2×104/ml接種在24孔培養(yǎng)板中,準(zhǔn)備免疫細(xì)胞化學(xué)染色。1.4mtt法檢測od采用MTT法。上述細(xì)胞培養(yǎng)7d左右,96孔培養(yǎng)板中的肝星狀細(xì)胞呈對數(shù)生長時,0.4%胎牛血清同步化處理72h,每組設(shè)5個復(fù)孔,36.5℃、濕度96%、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d,吸出培養(yǎng)液,0.05%(5mg/ml)的MTT200μl作用4h,吸出培養(yǎng)液后加入200μlDMSO并混勻,30min后用酶標(biāo)儀測定570nm處的OD值。1.5sabc法檢測tgf-1和ln的表達(dá)24孔培養(yǎng)板中的肝星狀細(xì)胞經(jīng)0.4%胎牛血清同步化處理72h,吸除上清,加DMEM1.5ml,每組設(shè)3個復(fù)孔,36.5℃、濕度96%、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d,吸出培養(yǎng)液,應(yīng)用SABC法檢測α-SMA、TGF-β1和LN的表達(dá)。細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色染色顆粒沉積者為陽性,按照顯色程度分弱、中、強(qiáng),分別用+、++、+++表示。顯色細(xì)胞數(shù)視野細(xì)胞總數(shù)<1/4為+,顯色細(xì)胞數(shù)占視野細(xì)胞總數(shù)的1/4～1/2為++,顯色細(xì)胞數(shù)占視野細(xì)胞總數(shù)的1/2～3/4為+++,顯色細(xì)胞數(shù)>視野細(xì)胞總數(shù)的3/4為++++。每組計數(shù)5個視野,顯色指數(shù)=顯色程度×顯色細(xì)胞比例。1.6統(tǒng)計方法采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。組間比較應(yīng)用t檢驗,檢驗水準(zhǔn)為0.05。2結(jié)果2.1各組大鼠血清中p肝星狀細(xì)胞OD值A(chǔ)組為0.0746±0.0131,B組為0.1106±0.0198,C組為0.0626±0.0137,A、B組均顯著低于C組,P分別<0.01和<0.05;A、B組比較無顯著差異(P>0.05)。2.2顯示組的顯色指數(shù)見表1。3肝星狀細(xì)胞增殖肝星狀細(xì)胞活化在肝纖維化形成中起重要作用。肝星狀細(xì)胞在受到損傷刺激后發(fā)生表型轉(zhuǎn)化,成為肌成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(MFB),二者均表現(xiàn)為desmin染色陽性,但后者還表達(dá)α-SMA,可作為肝星狀細(xì)胞活化的指標(biāo)。肝星狀細(xì)胞的活化受許多可溶性因子的作用調(diào)節(jié),包括生長因子、細(xì)胞因子、化學(xué)介質(zhì)、氧應(yīng)激產(chǎn)物等等。TGF-β1是最強(qiáng)的促肝星狀細(xì)胞纖維生成因子,具有強(qiáng)烈促肝星狀細(xì)胞合成ECM的作用,并通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)合成、促進(jìn)金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)及纖維蛋白溶解酶原激活物抑制因子-1(PAI-1)生成而抑制ECM降解。肝星狀細(xì)胞通過Ⅰ型受體(激活依賴Ⅱ型受體)促進(jìn)ECM合成,通過Ⅱ型受體抑制細(xì)胞增殖,Ⅲ型受體(即β聚糖)無信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能。靜息狀態(tài)的肝星狀細(xì)胞僅表達(dá)Ⅱ、Ⅲ型受體,而激活的肝星狀細(xì)胞三型受體均有表達(dá),且隨肝星狀細(xì)胞的激活,Ⅰ型增多,Ⅱ型減少,此可能更有利于其產(chǎn)生ECM,同時使TGF-β1的增殖抑制作用減弱。LN是分子量較大的糖蛋白,能與Ⅳ型膠原、非膠原性糖蛋白及硫酸肝素等多種基質(zhì)成分交聯(lián),并能自身交聯(lián),在基底膜的形成中發(fā)揮重要作用。Tanikawa報道,LN在正常肝竇不表達(dá),而在慢性肝炎碎片狀壞死灶和肝硬化纖維間隔附近的肝竇明顯表達(dá),肝硬化再生結(jié)節(jié)中的肝竇表達(dá)也增強(qiáng)。Castellot等于1985年提出,肝素在體外可抑制腎小球系膜細(xì)胞增生和分泌ECM。國內(nèi)袁桃霞等發(fā)現(xiàn)肝素在體外可抑制肝星狀細(xì)胞生長,并抑制其表達(dá)α-SMA、Ⅰ型及Ⅳ型前膠原;可減少肝星狀細(xì)胞Ⅰ型膠原、纖連蛋白的合成。本研究顯示,肝素可抑制體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞增殖及其α-SMA和LN表達(dá),說明肝素可抑制肝星狀細(xì)胞活化,減少LN分泌;且劑量越大、抑制作用越強(qiáng)。DeBleser等研究發(fā)現(xiàn),與正常大鼠肝臟的肝星狀細(xì)胞相比,肝纖維化大鼠肝星狀細(xì)胞中TGF-β1mRNA表達(dá)增加12倍,而TGF-β1表達(dá)增加可促進(jìn)肝星狀細(xì)胞合成ECM;正常大鼠肝臟中TGF-β1mRNA主要在枯否細(xì)胞內(nèi)表達(dá),內(nèi)皮細(xì)胞未見表達(dá)。肝纖維化大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞中均見TGF-β1mRNA強(qiáng)表達(dá),提示肝竇內(nèi)皮細(xì)胞亦在肝纖維化發(fā)生中起重要作用。本研究表明,肝素能夠抑制肝星狀細(xì)胞中TGF-β1的表達(dá),此可能為其抑制肝星狀細(xì)胞活化和分泌功能的機(jī)制之一。肝素是高度硫酸化的葡糖胺聚糖,硫酸乙酰肝素可在血管表面形成強(qiáng)大的負(fù)電荷,使血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的負(fù)電荷恢復(fù)正常,防止病毒、高膽固醇血癥等對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。我們以前的實驗結(jié)果亦證實,慢性乙型肝炎患者血漿血管性假性血友病因子(vWF)水平升高;肝素可顯著降低