抗腫瘤藥物篩選

抗腫瘤藥物篩選1整理課件抗腫瘤藥物篩選

是新藥發(fā)現與開發(fā)的重要環(huán)節(jié).通常是指從樣品到活性檢測至動物實驗療效各個階段的工作.一般常用以下幾種方法:1.腫瘤細胞組織培養(yǎng)篩選方法2.微生物學篩選方法Antitumordurgscreening。2整理課件1.腫瘤組織細胞培養(yǎng)篩選方法細胞培養(yǎng)法是篩選抗腫瘤藥物比較常用的一種方法.它包括人體腫瘤細胞和動物腫瘤細胞,培養(yǎng)方法包括單層細胞培養(yǎng)、瓊脂平板培養(yǎng)、細胞集落培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)、器官培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)等.觀察藥物活性的方法包括細胞形態(tài)、分裂相計數、脫氫酶活性、細胞染色、呼吸測定、熒光顯微鏡下染色反響、核酸蛋白質等生化測定以及同位素技術等.3整理課件當前,體外抗腫瘤活性實驗選用人癌細胞株,按常規(guī)細胞培養(yǎng)法進行培養(yǎng),使用四氮唑藍(MTT)復原法,磺羅丹明B染色法或集落形成法等測定藥物抗癌作用.本實驗除了用于抗腫瘤藥物的初步篩選外,還用于了解候選化合物的抗瘤譜,為隨后進行體內抗腫瘤實驗(如劑量范圍.腫瘤類別等)提供參考.4整理課件2.微生物學篩選方法盡管利用癌細胞體外培養(yǎng)作為抗腫瘤藥物的篩選模型要比利用微生物模型篩選出的體內有效的抗腫瘤藥物的命中率更大,但基于微生物生長與動物細胞代謝有這不少共同點,加上微生物學方法簡便,適合大量天然產物的初篩,因此,微生物學方法一直為國內外試驗室所采用.5整理課件噬箘體法噬菌體(bacteriophage,phage)是感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒的總稱，因局部能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。本世紀初在葡萄球菌和志賀菌中首先發(fā)現。噬菌體具有病毒的一些特性：個體微小。噬菌體基因組含有許多個基因，但所有的噬菌體都是細菌細胞中利用細菌的核糖體、蛋白質合成時所需的各種因子、各種氨基酸和能量產生系統(tǒng)來實現其自身的生長和增殖。一旦離開了宿主細胞，噬菌體既不能生長，也不能復制。

6整理課件7整理課件噬箘體8整理課件噬箘體的兩種類型噬菌體有毒〔烈〕性噬菌體和溫和噬菌體兩種類型。侵入宿主細胞后，隨即引起宿主細胞裂解的噬菌體稱作毒性噬菌體。毒性噬菌體被看作正常表現的噬菌體。溫和噬菌體那么是：當它侵入宿主細胞后，其核酸附著并整合在宿主染色體上，和宿主核算同步復制，宿主細胞不裂解而繼續(xù)生長。這種不引起宿主細胞裂解的噬菌體稱作溫和噬菌體.也即溶原性細菌.9整理課件★噬箘體法包括抗噬箘體法和溶原性菌誘導法兩種.細菌的噬箘體核酸大局部為雙鏈DNA,干擾DNA代謝的抗生素(如放線菌素.博來霉素)常也抑制噬箘體在細菌細胞內的生長,從而出現抗噬箘表達象.T4噬箘體吸附在大腸桿菌細胞10整理課件11整理課件應用誘導溶源性菌前噬箘體的方法篩選.溶源性菌的噬箘體DNA基因組直接螯合到細菌染色體DNA,不復制,因為大局部基因功能收到了“阻遏物〞抑制,但當活性“阻遏物〞的量由于細胞內或環(huán)境因子(物理的化學的)而降低時,溶源性就不能維持,前噬箘體就與染色體離開,進入自己的生長周期,又產生成熟的具感染性的噬箘體使細胞裂解,這種現象即為誘導作用.12整理課件★細菌變種法利用細菌為材料來篩選抗腫瘤抗生素主要有兩種方法.一類是人工培養(yǎng)變種,使細菌有一定的代謝特征.如使細菌糖酵解代謝增強等,或誘變生化變株,使細菌模仿腫瘤細胞的某種代謝特點或者使其對核酸或蛋白質合成的抑制劑有高度的敏感性.另一類是檢測突變作用,由于抗腫瘤藥物能使某些微生物產生突變作用,例如用依賴鏈霉素菌株來篩選藥物,如果使依賴鏈霉素菌株誘變?yōu)椴灰蕾囨溍顾?那么就有可能具有抗腫瘤作用.13整理課件★抗代謝法抗代謝物在含無機氮源的合成培養(yǎng)基中顯示抗癌作用,而在普通有機氮源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中無抗癌作用.利用這個特點,選擇無機氮源實驗有抗菌作用的物質,作為抗代謝的初篩方法.14整理課件★精原細胞法1.建立精原細胞法的依據造精過程可分為以下階段:A型精原細胞、B型精原細胞、靜止期初級精母細胞、初級精母細胞(細線期.偶線期.粗線期.雙線期.終變期)、次級精母細胞、精子細胞(園核精子細胞.長核精子細胞)、精子.在造精細胞系列中,對放射最為敏感的是B型精原細胞,其次是A型精原細胞,然后依次為精子細胞、精母細胞、精子.15整理課件精原細胞法陽性和抗腫瘤作用的相關性尤以在抗生素和植物藥中較為明顯.用精原細胞法檢測72種抗生素,精原細胞法陽性的13種抗生素,據已報道資料均屬抗腫瘤抗生素,其中9種在臨床上有一定療效.精原細胞法陰性的59種抗生素中,除又霉素、滅胞素、環(huán)己烯亞胺、螺旋霉素據報道在動物實驗有抗腫瘤活性外,其他55種均未見報道有抗腫瘤作用.在陰性的59種中,全部未見報道對腫瘤有臨床療效.說明精原細胞法檢測結果與體內實驗抗腫瘤作用有較好的相關性.16整理課件抗腫瘤藥物篩選的分子靶點、當前用于抗腫瘤藥物篩選的靶點種類繁多.主要有細胞周期調控信號轉導、細胞死亡通路、耐藥性侵襲轉移、血管生成等.1.抑制血管生成的篩選模型★在腫瘤發(fā)生的過程中,當腫瘤的體積超過0.2-2.0mm時,開始建立自己的血液供給系統(tǒng),即血管生成,為腫瘤的生長提供物質根底.腫瘤新生血管的滋養(yǎng)作用可為腫瘤細胞的生長提供營養(yǎng).氧氣和代謝交換等.而血管內皮細胞可通過旁分泌作用產生各種生長因子和刺激因子,如血小板源生長因子、胰島素樣生長因子、以及細胞因子白介素-6.白介素-8等.這些因子能夠誘導刺激腫瘤增殖和遷移.而且,腫瘤細胞與毛細血管形成結構上的密切關系.此外,腫瘤細胞和血管細胞具有相互作用.一方面血管內皮細胞產生的各種生長因子和細胞因子對腫瘤生長起到生長刺激作用;另一方面,腫瘤細胞可分泌血管內皮細胞生存和增殖所需的有絲分裂原和動力原等.17整理課件★抑制血管生成藥物的篩選方法如上所述,血管生成與腫瘤有著密切的聯系,因此近年來幾種體內和體外的分析系統(tǒng)已被用于篩選抑制血管生成藥物.體外分析系統(tǒng)包括血管內皮細胞的培養(yǎng)技術、血管內皮細胞在膠原基質上的遷移、血管內皮細胞的體外損傷效應和凋亡分析等.目前,腫瘤血管生成體內研究的生物試驗模型主要有動物(大鼠,兔等)、眼角膜囊(眼前房)、地鼠頰囊、裸鼠外耳皮下和雞胚絨毛尿囊膜等四種動物模型.18整理課件★以端粒酶為靶點的藥物篩選癌細胞的永生化是腫瘤生長和轉移的關鍵.腫瘤細胞內的端粒.端粒酶與此特征有非常重要的關系.研究資料說明,端粒酶幾乎在人類惡性腫瘤中有不同程度的高表達,其活性檢出率為85﹪-95﹪,而腫瘤周圍的正常組織及良性病變中的檢出率僅為4﹪.而且端粒酶活性與腫瘤的惡性程度,腫瘤的大小,淋巴結的轉移,腫瘤的分級和預後密切相關.目前,普遍認為端粒酶是一種新的.很有價值的腫瘤標志物.因此,端粒酶已成為抗腫瘤藥物篩選的新靶點.19整理課件端粒和端粒酶端粒是真核細胞線性染色體末端的一種特殊結構,由一段富含鳥嘌呤(G)的DNA串聯重復序列及相關蛋白質組成.具有高度保守性的端粒能夠保護染色體末端免于化學修飾或被核酶降解,防治染色體復制時末端粒的長度決定細胞的壽命,隨著細胞分裂的進行,端粒的長度逐漸縮短,當端?？s短到一定程度即不能維持染色體的穩(wěn)定時,細胞最終死亡.故有人稱端粒為〞生命的時鐘〞或〞有絲分裂的計數器〞.而大多數腫瘤的端粒長度不隨細胞分裂次數增加而縮短,具有無限分裂的能力,其原因在于端粒酶的存在.20整理課件

端粒酶是一種端粒酶能以自身的RNA為模板,逆轉錄合成端粒DNA序列添加到染色體末端,以補償細胞分裂時端粒DNA的縮短,使細胞克服危機期,成為永生細胞.RNA依賴的

DNA聚合酶,屬于核酸蛋白質復合物,由RNA和蛋白質兩種組分構成.大多數體細胞,端粒酶呈非激活狀態(tài).而大多數腫瘤細胞,端粒酶呈激活狀態(tài).21整理課件以端粒酶為靶點篩選的藥物

按藥物作用機制可分為直接以端粒酶核心組分(RNA局部和催化亞基)為靶標的藥物、以端粒的DNA為靶標的藥物、以端粒和端粒酶蛋白質組分為靶標的藥物等.如:通過端粒重復擴增法證實玉紅霉素及其類似物能抑制人端粒酶活性.如:茶葉中兒茶酚能夠直接強烈地抑制端粒酶活性.22整理課件★細胞凋亡通路的靶點誘導細胞凋亡必要的信號分子是一類絲氨酸蛋白酶,稱為Caspases家族.該家族共有十多個成員,可以彼此之間互相活化形成級聯反響.Caspasea活化有多種途徑.1細胞膜通路,是由腫瘤壞死因子(TNF)受體家族介導2線粒體通路,由線粒體誘導凋亡,主要靠釋放細胞色素C實現.后者可形成活化Caspases的多蛋白復合體.23整理課件★有關細胞周期調控的靶點腫瘤細胞生長的根本特征是細胞失控增殖,其細胞周期及關卡調控失常,故細胞周期蛋白依賴性激酶和關卡激酶可能作為抗腫瘤藥物的靶點.24整理課件★與侵襲轉移相關的靶點基質金屬蛋白酶(MMP)與腫瘤侵襲、轉移和血管生成有關.正常情況下,MMP受到內源性物質金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)嚴格控制.但在腫瘤那么出現MMP與TIMP的平衡失控.高侵襲轉移的腫瘤通常伴有MMP含量與活性的升高.MMP不僅由腫瘤細胞產生,同時也由反響的間質細胞包括成纖維細胞、內皮細胞、炎癥細胞產生.以MMP為靶點的藥物,其作用點不僅在于腫瘤細胞,也在于腫瘤部位的反映性間質細胞.近年來,小分子的MMP抑制劑已進入臨床研究.25整理課件抗腫瘤藥物篩選研究趨向分子生物學、分子藥理學與分子治療學的研究進展推動了分子靶向藥物的研制和臨床對靶向藥物療效的評價,使得我們可以從以下方面進行研究:1.藥物來源的多樣性.如化學合成的化合物、微生物、植物、海洋生物來源物質及生物制品等.2.藥物靶點的多樣性.既利用直接與腫瘤細胞生長相關的分子靶點,也利用與腫瘤微環(huán)境相關的分子靶點.利用多種多樣的分子靶點,將可能發(fā)現具有各種分子作用機制的藥