植物組培脫毒技術在農業(yè)生產中的應用

植物組培脫毒技術在農業(yè)生產中的應用

52年，法國成功采用生長點培養(yǎng)法獲得無病毒植物后，研究人員開始采用植物組培法對作物、園林和花卉進行脫毒研究。目前,已報道了600種以上病毒可引起植物病害。特別是無性繁殖的植物,很容易受到一種或多種病毒的侵染。隨著種質資源交換范圍的擴大,生態(tài)條件的改變,各種植物侵染病毒的種類越來越多,侵染范圍日益擴大,侵染程度日趨嚴重。目前,還沒有什么藥物能夠治愈病毒侵染植物所引起的病毒性病害。但可以通過植物組培脫毒技術來生產脫毒苗加以防治,因此植物組培脫毒技術顯得非常重要。脫毒技術的利用及脫毒良種的推廣,給農業(yè)帶來一場新的技術革命。通過脫毒,使作物恢復種性,增強抗性,生長健壯,光合作用增強,明顯提高了作物的產量和品質。如與相同品種的普通甘薯相比,脫毒甘薯的增產幅度可達20%~200%。尤其是該技術在馬鈴薯和甘薯上的應用,對其種植逐步走向規(guī)?；藴驶?、區(qū)域化具有重要意義。筆者介紹了植物組織培養(yǎng)脫毒技術的常用方法,主要介紹了近年發(fā)展玻璃化超低溫保存方法在植物脫毒上的應用,旨在為其科學利用提供參考。1植物組的一般脫毒技術1.1無病毒再生植株莖尖脫毒法的主要原理是病毒在植株體內的分布不均勻,隨植株部位及年齡而異,其中莖尖部分尤其生長點(0.1~1.0mm區(qū)域)帶病毒最少或不帶病毒,并且越靠近尖端,病毒濃度越低,感染也越低。因為病毒在寄主植物體內隨維管系統(tǒng)篩管轉移,在莖尖分生組織中沒有維管束系統(tǒng),病毒運動困難,所以,莖尖分生組織不含病毒粒子或病毒濃度很低,病毒在寄主莖尖分生組織中的轉移速度落后于莖尖的生長速度,導致頂端分生組織附近病毒濃度低,甚至不帶病毒。通過莖尖離體培養(yǎng)便可獲得無病毒再生植株。1955年,Moral等通過莖尖培養(yǎng),獲得了無馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯A病毒(PVA)和馬鈴薯Y病毒(PVY)的馬鈴薯植株。此后,這項技術快速發(fā)展,為解決馬鈴薯病毒危害提供了有效途徑,有效地解決了品種退化問題。莖尖脫毒的關鍵是莖尖大小和脫毒率,因為脫毒的成功率與所切下莖尖分生組織的大小成反比,為了提高脫毒率必須切下足夠小的莖尖分生組織(0.2~0.5mm)。然而,太小的莖尖分生組織再生成植株很困難,因為再生能力與分生組織的大小成正比。席夢利等對宜興百合脫毒培養(yǎng)得出接種0.3~0.5mm莖尖脫毒效果最好,對黃瓜花葉病毒(CMV)的脫毒率達到40%,小于0.3mm的莖尖不能培養(yǎng)成活。陸春霞等以直徑大小為0.2mm帶1~2個葉原基的馬鈴薯莖尖為外植體,其成活率與脫毒率較高,分別為68%和56%。董偉清等選取剝離0.5~0.6mm帶有1~2個葉原基的大蒜莖尖進行培養(yǎng),試管苗脫毒率達90%以上,脫毒效果明顯,雖然0.1~0.2mm莖尖脫毒效果好,但接種后難以成活。Wang等利用莖尖培養(yǎng)脫除葡萄病毒A時,當莖尖為0.2mm時,存活率為75%,脫毒率為12%;而當莖尖為0.1mm時,存活率為0;莖尖為0.4mm時,存活率為100%,而脫毒率為0。0.3~0.4mm莖尖培養(yǎng)對歐李蘋果褪綠斑病毒(ACISV)和李矮縮病毒(PDV)的脫毒率分別為71.6%和73.0%。東方百合組培脫毒時,莖尖小于0.3mm,成活率只有20%;小于0.1mm,全部死亡。1.2熱處理對馬鈴薯病毒的脫毒作用高溫脫毒原理是高溫可抑制病毒的增殖,減緩病毒在植株體內的擴散速度,而高溫對許多植物卻有加速其生長作用。針對不同植物、不同品種和不同植物病毒對溫度的敏感程度不同的特點,對需要脫毒的植株進行一定溫度和時間范圍內的熱力處理,使植物的生長速度明顯超過病毒在植株體內擴散的速度,從而使一部分正在迅速生長的植物組織,如頂芽、嫩稍的尖端不含病毒,把不含有病毒的部分切下接種到適宜的培養(yǎng)基上,最終培養(yǎng)出無毒植株。熱處理脫毒的方法主要有2種:熱水浸泡和高溫空氣處理。對于采用莖尖難以去除病毒的植株,常采用高溫處理和莖尖結合的方法,熱處理結合適宜的莖尖分生組織大小是獲得無病毒植株的關鍵因素。李文安指出,康乃馨莖尖經(jīng)38℃熱處理2個月,可使其病毒全部失活。馬鈴薯在35℃下處理幾個月能獲得無PVX的莖尖,而在相同條件下處理馬鈴薯塊莖20d即可除去卷葉病毒,而馬鈴薯植株經(jīng)熱處理再切取莖尖培養(yǎng),可除去馬鈴薯S病毒(PVS)和PVX2種病毒。Sanjeev等在脫除Kinnow(柑橘)印度柑橘壞斑病毒(ICSV)時,發(fā)現(xiàn)采用經(jīng)50℃水浴處理效果好于熱空氣處理,在40℃處理后的材料,切取其0.7mm莖尖,脫毒率達到60%。張藝萍等采用熱處理結合莖尖培養(yǎng)的方法,以帶有CMV病毒的東方百合栽培品種Siberia鱗莖為外植體,將組培苗熱處理后剝取較大的莖尖(0.4~0.6mm)進行培養(yǎng),待莖尖長成植株后再次剝取較大莖尖進行二次脫毒,經(jīng)檢測脫毒率可達80%,取得了較好的脫毒效果。席夢利等分別用熱空氣處理結合莖尖培養(yǎng)和熱水處理結合莖尖培養(yǎng)對百合脫毒,從脫毒效果看,隨著熱空氣處理或熱水處理時間的延長,脫毒率提高。切取長度0.8~1.0mm的莖尖培養(yǎng),熱空氣處理42d后,脫毒率可達40%。熱水處理40min珠芽再生的試管苗,脫毒率可達100%。Frantisek等采用熱處理蘋果,其中Idared有3個克隆完全脫除蘋果褪綠葉斑病毒(ACLSV)和蘋果莖痘病毒(ASPV),另一個品系Sampion3種病毒ACLSV、蘋果莖溝病毒(ASGV)和ASPV都未能脫除。而蘇佳明等將紅將軍蘋果試管苗在38℃高溫條件下恒定熱處理20d,二次莖尖培養(yǎng)后,試管苗脫毒率達86.4%~100.0%,可以有效脫除ASGV、ASPV和ACLSV等主要的蘋果病毒。應用熱處理脫毒也有一定的局限性,主要缺點在于并非所有病毒都對熱處理敏感。熱處理只對那些球狀的病毒(如葡萄扇葉病毒、蘋果花葉病毒)或線狀的病毒(如馬鈴薯X、Y病毒及康乃馨病毒)有效果,而對桿狀病毒(如牛蒡斑駁病毒、千日紅病毒)不起作用。1.3化學抗病毒試劑抗病毒化學藥劑能夠不同程度地脫除植物病毒,主要是利用抗病毒化學藥劑來抑制病毒核酸與蛋白質的合成或是改變寄主的代謝方式。采用病毒抑制劑與莖尖培養(yǎng)相結合的脫毒方法,可以較容易地脫除多種病毒,而且這種方法對取材要求不嚴,接種莖尖可大于1mm,易于分化出苗,提高存活率。目前用于植物脫毒的抗病毒藥劑主要包括嘌呤和嘧啶類似物、氨基酸、抗生素等,可在某種程度抑制植物體內或離體葉片內病毒的合成,但尚不能完全抑制病毒使其失活。常用于組織培養(yǎng)脫毒的化學抗病毒試劑主要有9-(2-羥二氧)甲基鳥嘌呤、2-硫尿嘧啶、疊氮胸苷、2,4-氧六氫三氮雜苯(DHT)和類似嘌呤堿基代謝物質三氮唑核苷(病毒唑)。姜玲等將墨蘭的原球莖頂端分生組織經(jīng)過20mg/L的三氮唑核苷處理,可以獲得100%的無病毒苗。Sharma等用25mg/L病毒唑處理37%柑橘ICRSV病毒,而疊氮胸苷和DHT對脫除印度柑橘壞斑病毒(ICRSV)幾乎沒有作用。Danci等在培養(yǎng)基中添加病毒唑,發(fā)現(xiàn)35mg/L的濃度對不同品種的馬鈴薯病毒脫除效果很好,可以達到60%~80%,比沒有添加病毒唑的莖尖處理脫毒效果高27%。Paunovic等采用40和60mg/L病毒唑處理,分別獲得15.38%和16.66%無李痘病毒(PPV)的歐洲李(PrunusdomesticaL.cvCacanskaLepotica)植株。但是有些病毒比較難去除,單獨使用其中某一個方法很難獲得成功,有人將熱處理、抗病毒藥劑和莖尖培養(yǎng)相結合使用,效果更好。Chen等利用這種方法去除了花生斑駁病毒。張惠華等對東方百合進行熱處理后結合10mg/L病毒唑來處理,百合無癥病毒(LSV)、百合斑駁病毒(LmoV)脫毒率分別達到55%和40%。1.4莖尖的脫除效果熱處理脫毒法、莖尖培養(yǎng)脫毒法、熱處理結合莖尖培養(yǎng)脫毒法和藥劑處理等都是傳統(tǒng)的脫毒方法。利用熱處理脫毒,不僅浪費時間,而且脫毒率很低。張志宏等利用變溫和恒溫熱處理均未能脫除草莓輕型黃邊病毒。利用莖尖培養(yǎng)脫毒法脫毒率與莖尖大小有關,雖莖尖越小,脫毒率越高,但是莖尖越小,存活率越低,而且操作難度加大,容易損傷莖尖。超低溫脫除植物病毒法是基于超低溫保存(Cryopreservation)結合組織培養(yǎng)和病毒檢測技術達到脫毒的目的。超低溫保存是種質資源長期保存的一種理想方法。因為在液氮中(-196℃)不僅可以長期保存植物材料,而且可以保證材料的遺傳穩(wěn)定性,并且要求的存貯空間最小,維護費用低。在超低溫處理過程中,導致細胞死亡主要發(fā)生在冰凍和凍融期間,在此期間,細胞的結構和功能受到嚴重損傷,致死凍融的細胞難以恢復生長而死亡。含有病毒的頂端細胞液泡較大,胞液中含有的水分也較多,在超低溫保存過程中易被形成的冰晶破壞致死,而增殖速度較快的分生組織含的水分少,胞質濃,抗凍性強,不宜被凍死(圖1)。這樣超低溫處理過的植株再生后可能是無病毒的,因此,超低溫保存作為一種可能去除病毒的方法而受到人們關注。Brison等首次報道采用莖尖超低溫保存方法成功去除了李樹PPV病毒,脫除率達到50%,而莖尖脫毒只有20%。Helliot等研究表明,香蕉莖尖通過超低溫保存,2%材料脫除香蕉(CMV),87%材料無香蕉條紋病毒(BSV)感染,而常規(guī)分生組織方法不能脫除CMV病毒,對BSV的脫除率只為76%。Wang等用玻璃化超低溫法去除了葡萄病毒A(GVA),成功率高達97%,而單獨的分生組織培養(yǎng)脫毒率僅為12%。蔡斌華等首次利用玻璃化超低溫法成功地去除了草莓輕型黃邊病毒(SMYEV),脫毒率達到95%。白建明等嘗試用超低溫保存法和常規(guī)方法(莖尖分生組織培養(yǎng)、溫熱療法以及溫熱療法結合莖尖分生組織培養(yǎng))來去除馬鈴薯試管苗中的馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(PSTVd)和PVX。結果顯示,馬鈴薯莖尖經(jīng)過超低溫保存后,存活率和成苗率分別為83.64%和72.04%,高于莖尖分生組織培養(yǎng)(46.67%和31.49%)、溫熱療法(72.22%和44.44%)以及溫熱療法結合莖尖分生組織培養(yǎng)(50.54%和30.38%)。4種方法都可以去除PVX,其中超低溫保存法的脫毒率最高,為59.13%,溫熱療法結合莖尖分生組織培養(yǎng)為56.02%,溫熱療法和莖尖分生組織培養(yǎng)較低,為42.61%和35.83%。曾繼吾等采用玻璃化法超低溫保存技術保存帶有香蕉束頂病毒(BBTV)的香蕉莖尖,再生后植株BBTV脫除率達到60.6%,而常規(guī)的莖尖培養(yǎng)對BBTV的脫除率僅為26.7%。采用玻璃化法超低溫保存還可以去除病原菌的感染,如黃龍病是影響世界柑橘產業(yè)的一種毀滅性病害,目前尚無有效方法防治,采用玻璃化超低溫法處理使柑橘黃龍病病原菌去除率達到98.1%,而采用莖尖分生組織脫毒法只有25.3%的植株無病原菌侵染。番茄小葉病植原體去除率達100%,而采用莖尖培養(yǎng)只有7%。病毒在植物體內的分布是不均勻的,在被感染的植株中莖尖分生組織通常不含有或病毒濃度非常小,病毒滴度隨著離分生穹頂不斷增加的距離而增加。分生穹頂?shù)募毎哂谐叽缧?、高核質率和含有小液泡的濃厚細胞質的特點。細胞的液泡隨著離分生穹頂距離的增加而變大。在超低溫保存過程中,莖尖分生組織細胞質濃、自由水含量低、抗凍能力強,這部分細胞經(jīng)過液氮保存后能夠成活,但莖尖分生組織外圍的細胞不具備分生組織的結構特點,經(jīng)過液氮保存后,細胞受到了嚴重損傷而死亡,即使保存莖尖較大,能夠成活的部分仍然是位于莖尖生長點含有高濃度細胞質的幾層分生細胞(圖1),這部分分生組織也是莖尖培養(yǎng)脫毒試圖要獲得的部位,經(jīng)過超低溫保存后再生的植株就來自這幾層不含病毒的分生細胞,所以再生材料脫除了病毒。光學顯微鏡觀察表明,香蕉經(jīng)過超低溫保存只有靠近分生組織的區(qū)域和葉原基細胞能夠成活。超微結構研究觀察顯示,香蕉莖尖在超低溫保存過程中,較大的細胞結構變化發(fā)生在冷凍或解凍環(huán)節(jié),大部分細胞發(fā)生了嚴重損傷,原生質體濃縮嚴重,細胞膜結構和細胞器受到傷害,細胞結構完整性被破壞。但莖尖中仍有小部分細胞在保存中未造成細胞器和膜結構的致命損傷,這小部分細胞位于莖尖(外面只有1~2層葉原基包裹)的頂端分生組織區(qū)域中,體積較小,結構致密,核質比率高,分裂旺盛,它們在高滲溶液的保護下,經(jīng)過一系列合適的脫水及解凍處理,雖然結構發(fā)生了一些變化,但培養(yǎng)后可以可逆性地恢復生活,由此再生成新的植株。Ding等對柑橘莖尖超低溫保存后光學顯微鏡和電鏡觀察結果也表明,位于頂端分生組織的無病原危害的小細胞,因為具有胞質濃度大,核質比大在液氮保存中可以存活,而有大液泡的大細胞因為水分含量高,經(jīng)液氮保存后死亡。與莖尖培養(yǎng)脫毒法和熱處理脫毒法等傳統(tǒng)的脫毒法相比,超低溫脫毒法不僅脫毒率很高,而且明顯優(yōu)于其他3種方法,主要表現(xiàn)在易于操作;存活率、再生率和脫毒率高;不需要昂貴的儀器;短時間內就可以生產出無毒植株。2早期植物病毒病的診斷和檢測技術通過不同脫毒途徑獲得的無病毒植株還必須經(jīng)過嚴格的病毒鑒定和檢測手段證明確實是無病毒良種種源,并要采取嚴密的防病毒重復污染措施才能取得預期效果。建立快速、高靈敏度、高通量的病毒檢測體系是病毒病預防和綜合防治的先決條件。植物病毒檢測技術經(jīng)歷了傳統(tǒng)生物學檢測技術、免疫學檢測技術和分子生物學檢測技術3個階段。早期對于植物病毒病的診斷及檢測的方法主要包括生物學鑒定和電子顯微鏡技術。目前,酶聯(lián)免疫吸附反應(ELISA)是植物病毒檢測最為常用的方法之一。但是ELISA方法需要制備抗體,而且一次只能檢測1種病毒。所以相比較來說,最有前途的應當是分子生物學技術。與其他方法相比,它特異性強、靈敏度高,而且不需要制備抗血清以及放射性探針,操作簡單,適用廣泛,隨著分子生物學技術的發(fā)展,分子生物學方法已經(jīng)成為植物病毒檢測的重要方法,主要包括核酸雜交技術、RT-PCR、熒光定量PCR、DNA微陣列技術等,已在植物病毒檢測及植物病毒病診斷體系中占有日益重要的地位,植物病毒病診斷途徑將更加趨向多元化,