自身骨髓間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)移植治療原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的臨床研究

自身骨髓間質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)移植治療原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的臨床研究

核電站心肌?。╟dm）是一種以室內(nèi)外擴(kuò)大和收縮功能減退為特征的核電站心肌疾病。因其病因未完全明確,目前尚缺乏特異的治療方法,內(nèi)科治療仍以控制心力衰竭為主。基礎(chǔ)和臨床研究認(rèn)為骨髓間質(zhì)干細(xì)胞可以改善缺血性心肌病的心功能,但在原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病中未見(jiàn)任何臨床相關(guān)報(bào)道。我們?cè)噲D通過(guò)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)自身骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bonemarrow-derivedmesenchymalstemcells,MSCs)移植治療原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病,探討該方法的臨床療效和安全性。細(xì)胞移植組elisa-pcr1.研究對(duì)象:選擇2002年1月至2004年10月在我院住院的原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者24例,隨機(jī)分為對(duì)照組和細(xì)胞移植組各12例。其中對(duì)照組男性8例,女性4例,平均年齡(58.4±11.0)歲;細(xì)胞移植組男性9例,女性3例,平均年齡(54.0±11.1)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡≤70歲;(2)根據(jù)1995年WHO/ISFC關(guān)于原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病的定義,心臟超聲示左室舒張末容積(LVEDd)在5.5~7.5cm,左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<45%;(3)排除繼發(fā)性擴(kuò)張型心肌病;(4)患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有活動(dòng)性感染、造血系統(tǒng)惡性疾患;(2)有腫瘤病史或其他可能影響短期存活的致死性疾病;(3)患者知情不同意。本研究方案通過(guò)本醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。2.方法:患者入院后隨機(jī)分為兩組,對(duì)照組和細(xì)胞移植組各12例,均接受常規(guī)抗心衰藥物治療,包括地高辛、利尿劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑和β腎上腺素能阻滯劑等。細(xì)胞移植組抽取右髂后上棘骨髓40ml,按照密度梯度離心法和貼壁篩選法在體外進(jìn)行分離和純化骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。將分離的單核骨髓細(xì)胞按2×106/ml接種于含10%患者自身血清的DMEM-LG培養(yǎng)基(購(gòu)自GIBCO公司)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞傳至第三代后,以CD34-PE、CD45-Pcy5、CD29-FITC、CD117-FITC、CD166-PE單克隆抗體(購(gòu)自BeckmanCoulter公司)做流式細(xì)胞學(xué)鑒定?；剌斍斑M(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)液細(xì)菌培養(yǎng),細(xì)胞計(jì)數(shù),臺(tái)盼藍(lán)染色,反復(fù)生理鹽水漂洗和220μm過(guò)濾去除細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì)胞移植組經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈造影,放入6FJL4或6FJR4指引導(dǎo)管,送鋼絲至各分支動(dòng)脈,然后沿鋼絲送入overthewire球囊至動(dòng)脈遠(yuǎn)端,經(jīng)球囊將含肝素的細(xì)胞懸液各1/3注射到左前降支、左回旋支和右冠狀動(dòng)脈內(nèi)。患者在手術(shù)后48h內(nèi)動(dòng)態(tài)心電監(jiān)護(hù)。對(duì)照組經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈造影時(shí)注射等量生理鹽水。兩組在術(shù)前和術(shù)后48h、3個(gè)月和6個(gè)月分別以ELISA法檢測(cè)血清白介素6(IL-6)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)(均購(gòu)自Bender公司試劑盒),以免疫散射比值法檢測(cè)血清高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP,試劑購(gòu)自BeckmanCoulter公司),術(shù)前和術(shù)后3、6個(gè)月分別檢測(cè)血漿腦鈉肽(BNP,儀器和試紙盒購(gòu)自BIOSITE,SanDiego,CA)、心臟超聲、24小時(shí)動(dòng)態(tài)心電監(jiān)測(cè)和6min步行試驗(yàn)。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,組間及自身前后比較用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞臺(tái)望藍(lán)染色細(xì)胞移植組接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)移植,平均細(xì)胞終濃度為(5.86±2.36)×105/ml,約30ml,細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)染色平均為98.6%。體外培養(yǎng)的MSCs細(xì)胞形態(tài)呈成纖維樣貼壁生長(zhǎng),流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)示細(xì)胞表面標(biāo)志CD29、CD117和CD166高表達(dá),CD34+和CD45呈低表達(dá)狀態(tài)。1.兩組患者術(shù)后血清il-6、tnf-及hs-crp水平比較細(xì)胞移植組在術(shù)前血清IL-6、TNF-α和hs-CRP水平與對(duì)照組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[分別為(2.45±0.76)比(2.69±0.62)ng/L,(26.85±16.62)比(26.33±22.56)ng/L,(1.25±0.77)比(0.93±0.55)mg/L,P均>0.05]。細(xì)胞移植組后血清IL-6(ng/L)水平與對(duì)照組比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[術(shù)后48h:(2.44±0.78)比(2.96±0.64);術(shù)后3個(gè)月:(2.76±1.04)比(2.79±0.47);術(shù)后6個(gè)月:(3.01±1.09)比(2.99±0.45),P均>0.05],與自身術(shù)前比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞移植組術(shù)后血清TNF-α(ng/L)水平與自身術(shù)前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與對(duì)照組比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[術(shù)后48h:(26.23±11.37)比(33.68±18.03);術(shù)后3個(gè)月:(25.38±15.21)比(21.92±12.00);術(shù)后6個(gè)月:(27.08±16.19)比(24.50±10.23),P均>0.05]。細(xì)胞移植組術(shù)后血清hs-CRP(mg/L)水平與自身術(shù)前比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,與對(duì)照組比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[術(shù)后48h:(1.49±0.87)比(1.03±0.66);術(shù)后3個(gè)月:(1.37±0.79)比(1.06±0.57);術(shù)后6個(gè)月:(1.26±0.87)比(1.22±0.79),P均>0.05]。2.細(xì)胞移植組與對(duì)照組術(shù)后6min步行路由、lvef和自身術(shù)前細(xì)胞移植組術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月血漿BNP水平,比術(shù)前增高,但與對(duì)照組比較降低,具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。術(shù)后3個(gè)月,細(xì)胞移植組6min步行路程較術(shù)前增加,但與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),術(shù)后6個(gè)月,細(xì)胞移植組6min步行路程與對(duì)照組比較,差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞移植組術(shù)后LVEF和對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[術(shù)后3個(gè)月:(0.28±0.15)比(0.31±0.10);術(shù)后6個(gè)月:(0.29±0.15)比(0.30±0.08),P>0.05],與自身術(shù)前(0.30±0.09)比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05。細(xì)胞移植組術(shù)后LVEDd與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[術(shù)后3個(gè)月:(6.69±0.66)比(6.43±0.70)cm;術(shù)后6個(gè)月:(6.62±0.69)比(6.54±0.64)cm,P>0.05],與自身術(shù)前(6.93±0.22)比較亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P>0.05。3.細(xì)胞移植組患者連續(xù)心電監(jiān)護(hù)情況細(xì)胞移植組在術(shù)前24小時(shí)動(dòng)態(tài)心電監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)有室性早博(1557.00±789.06)次,短串室性心動(dòng)過(guò)速(5.67±4.41)次,與對(duì)照組比較[室性早博(1603.75±897.47)次,短串室性心動(dòng)過(guò)速(7.97±7.25)次,P>0.05]。細(xì)胞移植術(shù)后48h連續(xù)心電監(jiān)護(hù)未發(fā)現(xiàn)有明顯的致心律失常事件。細(xì)胞移植組術(shù)后3個(gè)月和6個(gè)月的隨訪中,24小時(shí)心電監(jiān)測(cè)與對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[術(shù)后3個(gè)月:室性早博(1213.50±865.50)次比(1329.25±835.83)次,短串室性心動(dòng)過(guò)速(5.85±5.25)次比(5.77±5.00)次;術(shù)后6個(gè)月:室性早博(1281.50±725.92)次比(1384.75±811.15)次,短串室性心動(dòng)過(guò)速(4.99±3.75)次比(6.50±6.33)次,P>0.05]。4.細(xì)胞移植組患者生存率觀察過(guò)程中未發(fā)現(xiàn)有發(fā)熱、過(guò)敏反應(yīng)、栓塞事件等發(fā)生。隨訪期間兩組患者生存率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞移植組有1例在細(xì)胞移植術(shù)后8個(gè)月接受心臟移植,1例在細(xì)胞移植術(shù)后10個(gè)月死于頑固性心衰。對(duì)照組有2例死亡,分別在隨訪7~8個(gè)月時(shí),死于頑固性心力衰竭。經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)所mscs移植近年來(lái),擴(kuò)張型心肌病在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中進(jìn)行細(xì)胞移植有了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。有學(xué)者將平滑肌細(xì)胞和骨骼肌成肌細(xì)胞移植到阿霉素誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物模型中,發(fā)現(xiàn)移植細(xì)胞能夠在局部存活,并分化為肌管樣結(jié)構(gòu),與宿主心肌纖維緊密排列,增加了室壁張力和彈性,避免心腔過(guò)度擴(kuò)張。雖然移植細(xì)胞未能與宿主心肌細(xì)胞形成同步收縮,但通過(guò)限制心室重構(gòu),改善心功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在阿霉素誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物中進(jìn)行骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植,部分移植細(xì)胞也可以獲得心肌細(xì)胞表型,分化為心肌樣細(xì)胞和血管內(nèi)皮樣細(xì)胞。在原發(fā)性擴(kuò)張型心肌病中進(jìn)行干細(xì)胞治療至今未見(jiàn)相關(guān)的臨床資料。Ogawa等對(duì)1例患骨髓異常增生綜合征(MDS)和擴(kuò)張型心肌病的患者給予其兄弟的外周血干細(xì)胞移植,3個(gè)月99mTc心肌代謝定量心電圖門控SPECT(QGS)后發(fā)現(xiàn)左室容積減少,射血分?jǐn)?shù)增加,但10個(gè)月后心功能惡化。有學(xué)者認(rèn)為對(duì)于代償期DCM進(jìn)行細(xì)胞治療可能有助于緩解心室腔擴(kuò)大和室壁張力,但對(duì)于失代償期DCM不會(huì)有太大的收益,因?yàn)檫^(guò)大的室壁張力、低灌注和炎癥浸潤(rùn)可能不利于移植細(xì)胞的存活。腦鈉肽(BNP)是由心室分泌的一種調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能的多肽類激素,是一種評(píng)價(jià)左室功能、療效和預(yù)后的簡(jiǎn)單、快捷且可靠的方法。我們?cè)谠l(fā)性擴(kuò)張型心肌病患者中經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈內(nèi)自身MSCs移植,細(xì)胞移植術(shù)后3個(gè)月開(kāi)始,患者血漿BNP水平顯著下降,術(shù)后6個(gè)月移植組患者6min步行路程延長(zhǎng),運(yùn)動(dòng)耐量有一定程度的改善,但細(xì)胞移植組LVEF無(wú)顯著變化。雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明MSCs可以在阿霉素誘導(dǎo)的擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物模型的局部心肌組織中存活,部分細(xì)胞參與新生血管形成,但對(duì)于整體心功能改變結(jié)果不一。MSCs移植在缺血性心肌病患者中取得滿意的療效,而在擴(kuò)張型心肌病動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和我們的臨床研究中都未見(jiàn)顯著的心功能改變,可能與細(xì)胞移植的局部微環(huán)境以及心肌病變的機(jī)制