羊傳染性膿皰病毒的種屬特異性研究

羊傳染性膿皰病毒的種屬特異性研究

羊感染膿毒癥（通常稱為羊口傷口）是由病毒科和副痘毒科引起的羊感染膿毒癥，也被稱為羊口病毒。它的特點是羊和山羊的嘴唇、舌頭、鼻子、乳房和其他部位的皮膚和粘膜形成水泡、膿毒癥、潰瘍和厚殼。這種疾病通常是通過直接接觸和間接接觸引起的。主要影響3個月至6個月的羔羊和部分成年羔羊，發(fā)病率超過90%。該病呈世界性分布,且廣泛流行,在我國以西部地區(qū)流行較廣泛,是家畜疫病防控中的重要疫病之一。由于近年來肉羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速,而該病危害嚴(yán)重,給養(yǎng)羊業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。羊傳染性膿皰病毒(羊口瘡病毒)粒子呈橢圓形毛線團(tuán)樣外觀,長220nm~300nm,寬140nm~200nm,表面為“8”字型纏繞的螺旋結(jié)構(gòu)?；蚪M為線性雙鏈DNA,大小為134kb~139kb,中間是大的中央編碼區(qū),兩端為反向末端重復(fù)序列(ITRs)形成的共價閉合的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。目前公認(rèn)ORFV基因組包含16個開放閱讀框,約134個基因,其中127個為線性基因,基因組的G+C含量可達(dá)63%~64%。基因組中央核心區(qū)(ORFV009~111)相對保守主要包括與病毒復(fù)制和病毒粒子在細(xì)胞漿中裝配成熟有關(guān)的基因,主要調(diào)控病毒的復(fù)制、包裝和釋放。兩端(ORFV001~008和ORFV112~134)主要由與病毒的毒力、宿主范圍、免疫逃避及免疫調(diào)節(jié)有關(guān)的基因組成。目前對于ORFV基因組結(jié)構(gòu)及功能還不十分清楚,本文綜述了近年來ORFV研究進(jìn)展,闡述了ORFV基因組結(jié)構(gòu)及功能,以期對從事ORFV研究人員有所幫助。1或fv基因5的重復(fù)序列itrs區(qū)域的主要基因和功能1.1orfv200基因編碼的激活ORFV002基因編碼的蛋白具有抑制核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclearfactorkappaB,NF-κB)的作用,NF-κB廣泛存在于各種細(xì)胞中,具有多種應(yīng)激原。核因子κB抑制蛋白(inhibitorkappaB,IκB)是NF-κB的特異性抑制物,IκB激酶催化IκB的磷酸化,磷酸化的IκB能夠激活NF-κB。目前認(rèn)為NF-κB信號通路的主要過程為:NF-κB與IκB結(jié)合以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中,當(dāng)機體遭受病毒感染等因素刺激時,產(chǎn)生的各種激活誘導(dǎo)物(如細(xì)胞因子)與相應(yīng)細(xì)胞表面受體結(jié)合,募集腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)受體相關(guān)因子(tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor,TRAF)等結(jié)合蛋白,激活下游的激酶如NF-κB誘導(dǎo)激酶(NF-κBinducingkinase,NIK)等。這些激酶并不直接磷酸化IκB,而是將信號繼續(xù)傳遞至核因子κB抑制蛋白激酶(inhibitorkappaBkinase,IκK),由后者負(fù)責(zé)磷酸化IκB。磷酸化的IκB并未與NF-κB解離,而是迅即與泛素結(jié)合,引發(fā)IκB的泛素化并為26S蛋白酶體所識別而降解,暴露出NF-κB核定位信號和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,NF-κB入核并結(jié)合于特定基因的轉(zhuǎn)錄激活區(qū),激活特定基因轉(zhuǎn)錄。ORFV002基因編碼的蛋白通過干擾NF-κB-p65與NF-κB-p300之間的聯(lián)系而降低NF-κB-p65的乙?；?從而抑制NF-κB的信號通路。ORFV024基因和121基因也同樣具有抑制NF-κB的作用,但作用機制有所差異,ORFV024基因是通過逐步結(jié)合在IκK復(fù)合物的上游來抑制IκB激酶IκKα和IκKβ的磷酸化,ORFV121基因的抑制機制是ORFV121基因編碼的蛋白在細(xì)胞漿中和NF-κB-p65結(jié)合抑制了NF-κB-p65的磷酸化和核轉(zhuǎn)運,從而抑制了免疫相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。1.2rophosph東南角突變基因?qū)τ贠RFV007基因(dUTPase基因)及其編碼的脫氧尿苷焦磷酸酶(dUTPpyrophosphatase,dUTPase)的功能活性CottoneR等通過研究發(fā)現(xiàn),ORFV007基因是一個毒力基因,而對于缺失編碼dUTPase的基因或dUTPase活性低的病毒株,其對機體的致病性明顯降低,它很可能是由于該基因的缺失導(dǎo)致病毒在復(fù)制過程中出現(xiàn)了缺陷。1.3orfv編碼的細(xì)胞基序ORFV003、004、008基因是與決定宿主范圍有關(guān)的基因,且均編碼錨蛋白重復(fù)序列(ankyrinrepeat,ANK),ANK是普遍存在于生物體中的一種蛋白質(zhì)序列模體,F盒樣蛋白(F-BOX)基序已經(jīng)證明存在于大多數(shù)痘病毒的ANK中,它參與了宿主細(xì)胞的泛素∕蛋白酶體機制。ORFV編碼的這些ANK通過F-BOX蛋白基序介導(dǎo)作用降解宿主抗病毒因子,為ORFV的復(fù)制和跨種感染提供便利。ORFV共編碼7個ANK,在ORFV基因組3′ITRs的123、126、128、129基因也同樣編碼ANK。ORFV006基因是與ORFV毒力相關(guān)的基因,而ORFV001和005基因及編碼的蛋白的功能目前尚不清楚。2或fv基因中心的主要基因和功能2.1葉片白和orfv2l基因ORFV011基因(B2L基因)長1137bp,編碼的B2L蛋白大小為41.67ku,B2L蛋白是ORFV的主要囊膜蛋白與牛痘病毒(Vacciniavirus,VACV)的主要囊膜蛋白p37k的氨基酸同源性為42%。ORFVB2L基因比較保守編碼的B2L蛋白可刺激機體產(chǎn)生強烈的抗體反應(yīng),是ORFV的保護(hù)性抗原之一。ORFV編碼的B2L蛋白具有良好的免疫原性,這將在ORFV疫苗構(gòu)建方面起到重要作用。2.2orfv的抗氧化酶基因干擾素(interferon,IFN)的抗病毒作用主要是通過病毒與宿主在相互作用的過程中,宿主細(xì)胞會產(chǎn)生蛋白激酶(proteinkinase,PKR),PKR可以被細(xì)胞內(nèi)的dsRNA或病毒復(fù)制中間體激活,而激活的PKR可以使翻譯起始因子2的α亞單位(thealphasubunitofthetheinitiationfactor,eIF-2α)磷酸化,從而導(dǎo)致病毒蛋白的合成不能啟動,達(dá)到抑制病毒復(fù)制的目的。ORFV的干擾素抑制基因(Orfvirusinterferonresistancegene,OVIFNR基因)是一種先進(jìn)的抗IFN功能基因,編碼早期抗IFN的蛋白。蛋白能夠通過其羧基末端一段保守的基序競爭性結(jié)合dsRNA和病毒復(fù)制中間體,這樣就抑制了IFN誘導(dǎo)的PKR的激活,從而阻止宿主細(xì)胞IFN發(fā)揮終止病毒蛋白翻譯的作用。ORFV的OVIFNR基因與VACV的E3L基因的同源性為31%,而編碼的氨基酸的同源性為57%。研究發(fā)現(xiàn),體外用OVIFNR取代VACV的E3L,不會影響VACV的復(fù)制,但體內(nèi)致病力會嚴(yán)重受挫。2.3熱反應(yīng)蛋白和免疫部分ORFV059基因(F1L基因)位于ORFV基因組中部,長度為1005bp,是一個完整的開放閱讀框,其編碼產(chǎn)生的39ku蛋白是ORFV表面微管的組成成分之一,并且能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體,同時也能介導(dǎo)細(xì)胞免疫,因而該蛋白被認(rèn)為是刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要免疫原蛋白。該蛋白具有肝素結(jié)合活性,能夠與表達(dá)于大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素(Heparansulfate,HS)受體結(jié)合,因此該蛋白被認(rèn)為在病毒吸附和侵入過程中起到重要作用。2.4orfv86基因ORFV080基因編碼產(chǎn)生的蛋白與VACVA4L基因編碼產(chǎn)生的后期蛋白具有相似功能,其在病毒粒子核心蛋白的形成以及形態(tài)發(fā)生過程中起到了重要作用。ORFV086基因是一個高度保守的晚期基因。研究表明,19ku和70ku兩個多肽都是ORFV086基因編碼的蛋白(病毒核心蛋白p4a前體蛋白)的片段,這兩個片段在Glu-490至Arg-590區(qū)域間存在重疊,表明ORFV086基因編碼的蛋白的水解位點可能定位于這一區(qū)域,ORFV086基因編碼的蛋白與VACA編碼的p4a蛋白同源,VACA編碼的p4a蛋白為病毒含量最多的結(jié)構(gòu)蛋白,大約占病毒粒子重量的14%。3或fv基因3反向重復(fù)序列itrs區(qū)域的主要基因和功能3.1氨基端半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)ORFV112基因編碼一種趨化因子結(jié)合蛋白(chemokinebindingprotein,CBP蛋白),在病毒感染宿主的早期,趨化因子主要誘導(dǎo)白細(xì)胞向病毒感染部位聚集,根據(jù)趨化因子氨基端半胱氨酸殘基的排列,可將其分為4種類型,即CXC、CC、CX3C和C,其中X代表任意一種氨基酸殘基,它們是調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)。ORFV編碼產(chǎn)生的CBP蛋白結(jié)構(gòu)和功能與正痘病毒屬及黏液瘤亞群病毒屬病毒的Ⅱ型CBP蛋白相似,與CC-趨化因子(單核細(xì)胞趨化蛋白-1、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1a和RANTES)有高度的親和性,CBP蛋白與CC-趨化因子結(jié)合后能抑制單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞向感染部位集聚,與其他Ⅱ型CBP蛋白不同的是,ORFV編碼的CBP蛋白也可以與屬于C-趨化因子的淋巴細(xì)胞趨化因子結(jié)合,并通過XCR1受體抑制T、B細(xì)胞以及其他淋巴細(xì)胞向感染部位聚集。3.2抑制因子病毒ORFV117基因僅副痘病毒屬成員具有,該基因編碼產(chǎn)生的粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor,GM-CSF)抑制因子(inhibitorofgranulocytemacrophagecolony-stimulatingfactor,GIF)可以與細(xì)胞因子GM-CSF和白介素-2(IL-2)結(jié)合并抑制其生物活性。這段基因序列很可能是病毒與宿主在相互適應(yīng)過程中由于基因重組而獲得,有研究表明ORFV編碼的GIF蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上類似于Ⅰ型細(xì)胞因子受體家族。ORFV編碼的GIF蛋白與Ⅰ型細(xì)胞因子受體中也存在相似的結(jié)構(gòu),半胱氨酸殘基和WDPWV基序,WDPWV基序?qū)儆赪SXWS基序(其中X可代表任意氨基酸),對OR-FV編碼的GIF蛋白進(jìn)行定點突變表明二硫鍵和WDPWV序列是其維持生物學(xué)活性所必需的結(jié)構(gòu)。3.3v13基因編碼在細(xì)胞凋亡過程中,Bcl-2家族成員起著至關(guān)重要的作用。ORFV125基因編碼的蛋白與抑制細(xì)胞凋亡有關(guān),該蛋白能夠抑制紫外線引起的Bcl-2家族成員Bax和Bak凋亡的激活,是Bcl-2的抑制因子,也是副痘病毒屬第一個被證實的抑制細(xì)胞凋亡的蛋白。3.4vil-10的氨基酸同源性O(shè)RFV127基因編碼的白介素-10(virusinterleukin-10,vIL-10)通常為185個氨基酸,大小約21.7ku。是ORFV早期表達(dá)的基因之一,ORFV毒株NZ2編碼的vIL-10與其他物種編碼的白介素10(interleukin-10,IL-10)的氨基酸同源性如下:綿羊(80%)、牛(75%)、人(67%)、鼠(64%)、人類皰疹病毒Ⅳ型(63%),馬皰疹病毒(67%)。vIL-10能抑制Th1細(xì)胞的增殖及IL-2、IL-3、IFN-γ和GM-CSF等細(xì)胞因子的合成以及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞分泌TNF-α、IL-8和IFN-γ。ORFVvIL-10基因在病毒成功感染宿主過程中起到了重要作用。3.5orfv與vegf蛋白表達(dá)的相關(guān)性O(shè)RFV的血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)基因是其早期翻譯的重要毒力基因之一,ORFV各毒株編碼的VEGF差異較大,MercerA等檢測了21株不同來源的OR-FV編碼的VEGF發(fā)現(xiàn)其中大多數(shù)與NZ2毒株編碼的VEGF相似,但預(yù)測的氨基酸序列相互間的突變率卻達(dá)到30.8%,ORFV的VEGF基因具有易變性,而ORFV各毒株編碼的VEGF都保守有功能相關(guān)結(jié)構(gòu),與其他類型的VEGF具有相似功能,能促使表皮細(xì)胞增生,引起宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和毛細(xì)血管通透性增加等廣泛的血管變化。4orfv結(jié)構(gòu)和功能基因研究發(fā)現(xiàn)中央核心區(qū)B2L和F1L基因編碼的蛋白能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體,這對ORFV疫苗的研制具有重要作用。ORFV作為副痘病毒屬的代表成員,已進(jìn)化出了一整套免疫逃避機制。ORFV的OVIFNR基因、CBP基因、GIF基因、vIL-10基因和VEGF基因在病毒抵抗宿主的免疫反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用。ORFV在