多糖的提取分離方法

1.多糖的提取辦法生物活性多糖重要有真菌多糖、植物多糖、動物多糖3大類。多糖的提取首先要根據多糖的存在形式及提取部位，決定在提取之前與否做預解決。動物多糖和微生物多糖多有脂質包圍，普通需要先加入丙酮、乙醚、乙醇或乙醇乙醚的混合液進行回流脫脂，釋放多糖。植物多糖提取時需注意某些含脂較高的根、莖、葉、花、果及種子類，在提取前，應先用低極性的有機溶劑對原料進行脫脂預解決，現在多糖的提取辦法重要有溶劑提取法、生物提取法、強化提取法等。1．1溶劑法1．1．1水提醇沉法水提醇沉法是提取多糖最慣用的一種辦法。多糖是極性大分子化合物，提取時應選擇水、醇等極性強的溶劑。用水作溶劑來提取多糖時，能夠用熱水浸煮提取，也能夠用冷水浸提滲濾，然后將提取液濃縮后，在濃縮液中加乙醇，使其最后體積分數達成70%左右，運用多糖不溶于乙醇的性質，使多糖從提取液中沉淀出來，室溫靜置5h，多糖的質量分數和得率均較高。影響多糖提取率的因素有：水的用量、提取溫度、浸提固液比、提取時間以及提取次數等。水提醇沉法提取多糖不需特殊設備，生產工藝成本低，安全，適合工業(yè)化大生產，是一種可取的提取辦法。但由于水的極性大，容易把蛋白質、苷類等水溶性的成分浸提出來，從而使提取液寄存時腐敗變質，為后續(xù)的分離帶來困難，且該法提取比較耗時，提取率也不高。1．1．2酸提法為了提高多糖的提取率，在水提醇沉法的基礎上發(fā)展了酸提取法。如某些含葡萄糖醛酸等酸性基團的多糖在較低pH值下難以溶解，可用乙酸或鹽酸使提取液成酸性，再加乙醇使多糖沉淀析出，也可加入銅鹽等生成不溶性絡合物或鹽類沉淀而析出。由于H＋的存在克制了酸性雜質的溶出，稀酸提取法提獲得到的多糖產品純度相對較高，但在酸性條件下可能引發(fā)多糖中糖苷鍵的斷裂，且酸會對容器造成腐蝕，除弱酸外，普通不適宜采用。因此酸提法也存在一定的局限性之處。1．1．3堿提法多糖在堿性溶液中穩(wěn)定，堿有助于酸性多糖的浸出，可提高多糖的收率，縮短提取時間，但提取液中含有其它雜質，使粘度過大，過濾困難，且浸提液有較濃的堿味，溶液顏色呈黃色，這樣會影響成品的風味和色澤。1．1．4超臨界流體萃取法超臨界流體萃取技術是近年來發(fā)展起來的一種新的提取分離技術。超臨界流體是指物質處在臨界溫度和臨界壓力以上時的狀態(tài)，這種流體兼有液體和氣體的特點，密度大，粘稠度小，有極高的溶解，滲入到提取材料的基質中，發(fā)揮非常有效的萃取功效。并且這種溶解能力隨著壓力的升高而增大，提取結束后，再通過減壓將其釋放出來，含有保持有效成分的活性和無溶劑殘留等優(yōu)點。由于CO2的超臨界條件（TC＝304．6℃，Tp＝7．38MPa）容易達成，慣用于超臨界萃取的溶劑，在壓力為8～40MPa時的超臨界CO2足以溶解任何非極性、中極性化合物，在加入改性劑后則可溶解極性化物。該法的缺點是設備復雜，運行成本高，提取范疇有限。1．2酶解法1．2．1單一酶解法單一酶解法指的是使用一種酶來提取多糖，從而提高提取率的生物技術。其中經常使用的酶有蛋白酶、纖維素酶等。蛋白酶對植物細胞中游離的蛋白質含有分解作用，使其構造變得松散；蛋白酶還會使糖蛋白和蛋白聚糖中游離的蛋白質水解，減少它們對原料的結合力，有助于多糖的浸出。1．2．2復合酶解法復合酶解法采用一定比例的果膠酶、纖維素酶及中性蛋白酶，重要運用纖維素酶和果膠酶水解纖維素和果膠，使植物組織細胞的細胞壁破裂，釋放細胞壁內的活性多糖，多糖釋放的多少和復合酶的加入量、酶解溫度、酶解時間、酶解pH值有直接的關系。酶解法提取的實質是通過酶解反映強化傳質過程。此法含有條件溫和、雜質易除和得率高等優(yōu)點。1．3物理強化法1．3．1微波輔助提取法微波萃取是高頻電磁波穿透萃取媒質，達成被萃取物料的內部，能快速轉化為熱能使細胞內部溫度快速上升，細胞內部壓力超出細胞壁承受力，細胞破裂，細胞內有效成分流出，在較低的溫度下溶解于萃取媒質，通過進一步過濾和分離，獲得萃取物料。微波輔助提取多糖和其它的萃取辦法比較，微波萃取效率高，操作簡樸，且不會引入雜質，多糖純度高，能耗小，操作費用低，符合環(huán)保規(guī)定，是較好的多糖提取辦法。1．3．2超聲波輔助提取法超聲波提取是運用超聲波的機械效應、空化效應及熱效應。機械效應可增大介質的運動速度及穿透力，能有效的破碎生物細胞和組織，從而使提取的有效成分溶解于溶劑之中；空化效應使整個生物體破裂，整個破裂過程在瞬間完畢，有助于有效成分的溶出；熱效應增大了有效成分的溶解速度，這種熱效應是瞬間的，可使被提取成分的生物活性盡量保持不變；另外，許多次級效應也能增進提取材料中有效成分的溶解，提高了提取率。超聲波提取與水煮法醇沉法相比，萃取充足，提取時間短；與浸泡法相比，提取率高。1．3．3高壓脈沖法高壓脈沖法是對兩電極間的流態(tài)物料重復施加高電壓的短脈沖（典型為20～80kV/cm）進行解決，作用機理有多個假說，如細胞膜穿孔效應、電磁機制模型、粘彈極性形成模型、電解產物效應、臭氧效應等，研究最多的是細胞膜穿孔效應。動物、植物、微生物的細胞，在外加電場作用下，產生橫跨膜電位，絕緣的生物膜由于電場形成了微孔，通透性發(fā)生變化，當整個膜電位達成極限值（約為1V）時，膜破裂，膜構造變成無序狀態(tài)，形成細孔，滲入能力增強。電位差達成臨界點，細胞破裂。2.多糖的分離純化2．1除蛋白2．1．1Sevage法根據蛋白質在氯仿等有機溶劑中變性的特點，用V（氯仿）∶V（戊醇或正丁醇）為5∶1或4∶1，混合物激烈振搖20～30min，蛋白質變性生成凝膠，離心分離，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質。此種只能除去少量蛋白質，效率不高，須重復多次，多糖有損失。但此辦法比較溫和，在避免多糖降解上效果較好，如配合加入某些蛋白質水解酶，用Sevage法效果更佳。此法不能除去脂蛋白，由于脂蛋白溶于氯仿。2．1．2三氟三氯乙烷法將多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫攪拌10min左右，離心分離得上層水層，水層繼續(xù)用上述辦法重復解決幾次，得無蛋白質的多糖溶液，此法效率較Seavg法高，但溶劑沸點低，易揮發(fā)，不適宜大量應用。2．1．3三氯乙酸法三氯乙酸是一種有機酸，使多糖提取液中的蛋白質與有機酸作用而變性沉淀。該法是在多糖水提液中滴加5%～10%與多糖水提取液等體積的三氯乙酸，混勻靜置過夜，離心除去膠狀沉淀，重復以上的操作直至溶液不再繼續(xù)混濁為止，得無蛋白質的多糖。三氯乙酸濃度越大，除蛋白質效果越好，但對多糖的影響也越大，可能是三氯乙酸對多糖構造含有破壞作用，使多糖降解，并且這種破壞作用隨著三氯乙酸濃度增大而增強。植物多糖常采用三氯乙酸法除蛋白質，也可先用蛋白水解酶，使樣品中的蛋白質部分降解后再用Sevag法效果更加好；微生物多糖去除蛋白常采用Sevag法、三氟三氯乙烷法；也可用鹽析法、有機溶劑萃取等辦法除蛋白。2．2多糖的分離重要有分級沉淀、季銨鹽沉淀法、金屬鹽沉淀法、色譜分離、膜分離、透析、電滲析等，現在大多采用DEAE－凝膠或其它多個不同類型的凝膠柱層析以及離子交換色譜法。2．2．1分級沉淀法大多數活性多糖可溶于水，3個碳下列的多糖還可溶于乙醇，隨著聚合度的增大，多糖在乙醇中的溶解度逐步減少。根據這一性質可在多糖的濃縮水溶液中分批加入乙醇，使乙醇的體積濃度逐步增加到50，100，200，900mL/L，從而使不同聚合度的多糖分別沉淀析出。2．2．2色譜分離法慣用兩種色譜分離辦法：一是凝膠柱色譜法，二是離子交換色譜法。2．2．3膜分離法膜分離技術（membraneseparationtechnology，MST）是一種高效分離技術，分離過程以選擇透過性膜作為分離介質，通過在膜兩側施加某種推動力（壓力差、化學位差、電位差等），使原料液中組分有選擇性的通過膜。現在應用較多的是超濾和微濾技術。3多糖的分析鑒定3．1含量的測定測定辦法：硫酸－苯酚法、硫酸－蒽酮法、比色定量法、分光光度法、紙色譜法、離子交換色譜法、yaphe法、薄層色譜法、酶法、原子吸取法、HPLC法、凝膠電泳法、親和電泳法、持續(xù)流動分析法檢測法[44]、次亞碘酸鹽定量法、蒽酮－硫酸法（總糖）、DNS法（還原法）、磷鉬比色法、鄰鉀苯胺比色法等。每種辦法只對某些多糖的測量效果好。比色法、分光光度法、離子交換色譜法、酶法和電泳法等可同時用于多糖的定性定量分析。3．2純度鑒定多糖是高分子化合物，其純品微觀上是不均一的，普通所說的多糖純品實質上是一定分子量范疇的均一組分。多糖純度鑒定的慣用辦法：超離心、高壓電泳、凝膠層析、HLPC法等?，F在應用較多的是HLPC法，旋光度測定也是純度測定的一種辦法。3．3分子量的測定多糖分子量的測定是研究多糖性質的一項重要工作。慣用辦法：滲入壓法、蒸氣壓滲入劑法、端基法、粘度法、光散射法、凝膠色譜法、超出率法、沉淀法、凝膠電泳法、HPLC法、超離心分析法、分子篩色譜法、GPC法、MALDI－TOF－MS法。3．4構造測定3．4．1多糖一級構造測定多糖的一級構造分析，重要是分析構成多糖的單糖類型、數目、連接方式及苷建構型。慣用化學法和儀器分析法。多糖組分與分子比例測定法：部分酸解法、完全酶解法、色譜法；吡喃、呋喃環(huán)形式構造的分析：紅外光譜；連接次序：選擇性光譜法、糖苷鍵次序水解、核磁共振；α－β－異頭異構體：糖苷酶水解、核磁共振；羥基被取代狀況：甲基化反映、氣相色譜、過碘酸氧化、Smith降解法和測硫酸基法（terho法）、核磁共振、質譜法；糖鏈、肽鏈連接方式：單糖與氨基酸構成、稀堿水解法、肼解反映；多糖構造的分析辦法諸多，迄今沒有一種辦法能夠單獨完畢多糖構造的分析。儀器分析與化學辦法相結合是慣用的多糖構造測定辦法。3．4．2多糖高級構造測定現在研究多糖的二級構造慣用的手段是NMR技術，如2D－NMR，13C譜，通用的辦法是將當代NMR技術與理論計算相結合通過一定的理論計算篩選構象，重要的理論計算辦法有從頭計算、豐度經驗計算及經驗力場計算。圓二色譜法（CD）也可用于糖的構象分析，近年來，以精確三維構造知識為基礎揭示重要生命活動的規(guī)律已達成前所未有的深度和廣度，多糖作為一類重要的生物活性大分子其構造的研究勢必推動對多糖的認識向深層次發(fā)展。3、通過活動，使學生養(yǎng)成博覽群書的好習慣。B比率分析法和比較分析法不能測算出各因素的影響程度?！藽采用約當產量比例法，分派原材料費用與分派加工費用所用的竣工率都是一致的。ＸC采用直接分派法分派輔助生產費用時，應考慮各輔助生產車間之間互相提供產品或勞務的狀況。錯C產品的實際生產成本涉及廢品損失和停工損失?！藽成本報表是對外報告的會計報表?！罜成本分析的首要程序是發(fā)現問題、分析因素。×C成本會計的對象是指成本核算?！罜成本計算的輔助辦法普通應與基本辦法結合使用而不單獨使用?！藽成本計算辦法中的最基本的辦法是分步法。XD當車間生產多個產品時，“廢品損失”、“停工損失”的借方余額，月末均直接記入該產品的產品成本中?！罝定額法是為了簡化成本計算而采用的一種成本計算辦法?！罠“廢品損失”賬戶月末沒有余額。√F廢品損失是指在生產過程中發(fā)現和入庫后發(fā)現的不可修復廢品的生產成本和可修復廢品的修復費用。ＸF分步法的一種重要特點是各環(huán)節(jié)之間要進行成本結轉。(√)G各月末在產品數量變化不大的產品，可不計算月末在產品成本。錯G工資費用就是成本項目。(×)G歸集在基本生產車間的制造費用最后均應分派計入產品成本中。對J計算計時工資費用，應以考勤統(tǒng)計中的工作時間統(tǒng)計為根據。(√)J簡化的分批法就是不計算在產品成本的分批法。(×)J簡化分批法是不分批計算在產品成本的辦法。對J加班加點工資既可能是直接計人費用，又可能是間接計人費用?！蘆接生產工藝過程的特點，工業(yè)公司的生產可分為大量生產、成批生產和單件生產三種，XK可修復廢品是指技術上能夠修復使用的廢品。錯K可修復廢品是指通過修理能夠使用，而不管修復費用在經濟上與否合算的廢品。ＸP品種法只合用于大量大批的單環(huán)節(jié)生產的公司?！罳公司的制造費用一定要通過“制造費用”科目核算。ＸQ公司職工的醫(yī)藥費、醫(yī)務部門、職工浴室等部門職工的工資，均應通過“應付工資”科目核算。ＸS生產車間耗用的材料，全部計入“直接材料”成本項目。ＸS適應生產特點和管理規(guī)定，采用適宜的成本計算辦法，是成本核算的基礎工作。(×)W竣工產品費用等于月初在產品費用加本月生產費用減月末在產品費用。對Y“預提費用”可能出現借方余額，其性質屬于資產，事實上是待攤費用。對Y引發(fā)資產和負債同時減少的支出是費用性支出。XY以應付票據去償付購置材料的費用，是成本性支出。XY原材料