流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子的研究進(jìn)展

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子的研究進(jìn)展

主要活性物質(zhì)和環(huán)境反應(yīng)的主要指南和調(diào)節(jié)。正常情況下,細(xì)胞因子的表達(dá)和分泌受到嚴(yán)格的調(diào)控,病理狀態(tài)下會(huì)出現(xiàn)異常表達(dá),故檢測(cè)細(xì)胞因子對(duì)于疾病的診斷、治療具有重要意義。細(xì)胞因子免疫學(xué)檢測(cè)方法基本原理是將細(xì)胞因子作為抗原,用針對(duì)該抗原的特異性抗體進(jìn)行定量或定性的檢測(cè)。既往檢測(cè)技術(shù)主要采用ELISA法,由于細(xì)胞因子半衰期不同,其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性降低。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)(enzyme-linkedimmunospotassay,ELISPOT)檢測(cè)的是分泌細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量,不受細(xì)胞因子代謝的影響,能比較真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)細(xì)胞因子水平,已得到廣泛研究并應(yīng)用到臨床結(jié)核感染的診斷中。流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)能明確產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞數(shù)量,不僅可同時(shí)檢測(cè)幾種細(xì)胞因子,還可確定產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞亞型,是一種相對(duì)快速并能準(zhǔn)確定量的檢測(cè)細(xì)胞因子的方法。一、fcm檢測(cè)細(xì)胞因子的方法FCM是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種對(duì)液流中排成單列的細(xì)胞或其他生物微粒逐個(gè)進(jìn)行快速定量分析和分選的技術(shù),可測(cè)定細(xì)胞大小、DNA/RNA含量、細(xì)胞表面抗原表達(dá)等多種參數(shù),也可分類收集特定的細(xì)胞或細(xì)胞器,臨床上廣泛應(yīng)用于感染性疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤學(xué)等多個(gè)學(xué)科。FCM檢測(cè)ICK的方法是運(yùn)用熒光標(biāo)記的抗細(xì)胞表面抗原單抗和抗細(xì)胞因子單抗,檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)多個(gè)細(xì)胞因子,可區(qū)分表達(dá)特定細(xì)胞因子的細(xì)胞亞群,不僅能了解細(xì)胞因子的量和產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞類型,還能了解細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)。FCM檢測(cè)ICK技術(shù)主要是通過細(xì)胞因子特異的單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)免疫熒光染色,并結(jié)合膜表面抗原染色,用多色FCM分析各種細(xì)胞內(nèi)合成的細(xì)胞因子,并對(duì)免疫細(xì)胞進(jìn)行分類,如輔助性T細(xì)胞(Th1、Th2)等,為疾病的早期診斷和治療提供重要依據(jù)。方法是通過體外多克隆激活劑激活細(xì)胞,同時(shí)以阻斷劑阻斷胞內(nèi)高爾基體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),抑制細(xì)胞因子釋放到細(xì)胞外,使產(chǎn)生的細(xì)胞因子在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蓄積,使其信號(hào)增強(qiáng)。經(jīng)細(xì)胞膜固定和破膜劑增加細(xì)胞的通透性后,用抗細(xì)胞因子的抗體與細(xì)胞內(nèi)特定的分子相結(jié)合,通過非相關(guān)特異性同型匹配的抗體作為對(duì)照,確定靜止的與無細(xì)胞因子分泌的細(xì)胞的最小熒光背景,既可用FCM檢測(cè)不同的細(xì)胞亞群分泌的ICK。二、在其他領(lǐng)域的研究和應(yīng)用FCM技術(shù)在腫瘤疫苗、HIV感染、自身免疫病等領(lǐng)域已得到較為廣泛的研究和應(yīng)用。近年來,FCK檢測(cè)ICK技術(shù)在結(jié)核感染的診斷及治療療效評(píng)價(jià)等方面也進(jìn)行了較為深入的研究并取得一定進(jìn)展。1.mdna的耐藥基因檢測(cè)結(jié)核菌素試驗(yàn)是檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染的傳統(tǒng)檢測(cè)手段,但其與卡介菌和環(huán)境分枝桿菌存在交叉反應(yīng),其特異性較差。由于IFN-γ是細(xì)胞免疫介導(dǎo)的最為關(guān)鍵的細(xì)胞因子,因此應(yīng)用結(jié)核特異性抗原檢測(cè)特異性T淋巴細(xì)胞合成或分泌IFN-γ的濃度或效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的數(shù)量可以判斷機(jī)體是否感染結(jié)核分枝桿菌。Cosmi等應(yīng)用FCM細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)對(duì)活動(dòng)性結(jié)核、隱性結(jié)核感染、卡介苗接種者和健康志愿者的全血標(biāo)本,應(yīng)用結(jié)核菌素純蛋白衍生物(PPD)和早期分泌抗原靶蛋白-6(ESAT-6)作為抗原,檢測(cè)CD4+T細(xì)胞的表達(dá),結(jié)果提示,活動(dòng)性結(jié)核、結(jié)核潛伏感染患者的PPD特異性T淋巴細(xì)胞比例較BCG接種的志愿者明顯升高。抗原培育后,活動(dòng)性結(jié)核、結(jié)核潛伏感染患者較未接種卡介苗及接種卡介苗的健康志愿者CD4+CD69+IFN-γT細(xì)胞明顯升高,而在未接種卡介苗與接種卡介苗的健康志愿者中ESAT-6特異性淋巴細(xì)胞未見明顯區(qū)別。提示應(yīng)用流式技術(shù),ESAT-6作為抗原可鑒別出結(jié)核潛伏感染與健康志愿者和BCG接種者。同時(shí),還可鑒別出TST陰性的結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌感染。提示流式胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)技術(shù)較TST在診斷結(jié)核感染方面有更高的陽性預(yù)測(cè)值。研究證實(shí),采用多色免疫熒光和胞內(nèi)細(xì)胞因子的染色技術(shù),以ESAT-6作為抗原,檢測(cè)抗原特異性CD4+T淋巴細(xì)胞,均得到較高的陽性率,提示此方法可作為結(jié)核感染的一種診斷手段。2.細(xì)胞因子檢測(cè)在細(xì)胞因子的多項(xiàng)檢測(cè)研究中,應(yīng)用不同的抗原及不同的培養(yǎng)時(shí)間,有時(shí)會(huì)得到迥異的結(jié)果。Antas等應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)結(jié)核患者細(xì)胞因子產(chǎn)生的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究,以PPD作為抗原,測(cè)定結(jié)核患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcells,PBMC)抗原特異性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)并對(duì)不同時(shí)間段(8、12、16、20及24h)細(xì)胞因子的產(chǎn)生進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察,結(jié)果顯示,IFN-γ產(chǎn)生的峰值時(shí)間為16h,IL-4產(chǎn)生的峰值時(shí)間為24h。培養(yǎng)后用流式方法很快就可檢測(cè)出細(xì)胞因子,而上清中細(xì)胞因子濃度需在培養(yǎng)后24h方可檢出。因?yàn)榕囵B(yǎng)上清中的細(xì)胞因子的水平代表的是分泌的細(xì)胞因子數(shù)量,它受細(xì)胞因子合成、轉(zhuǎn)運(yùn)、在高爾基體的聚集及分泌幾種參數(shù)的影響,而胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)只受細(xì)胞因子合成的影響,因此,FCM檢測(cè)ICK技術(shù)是一種更可靠且重復(fù)性好的檢測(cè)細(xì)胞因子的方法。3.抗結(jié)核治療后細(xì)胞中ifn-的表達(dá)為了明確結(jié)核患者治療前后細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化,Veenstra等對(duì)結(jié)核患者外周全血經(jīng)抗CD3單克隆抗體刺激后進(jìn)行檢測(cè),CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞比例最高達(dá)13%,較非結(jié)核患者有明顯升高,而抗結(jié)核治療1周后,產(chǎn)生IFN-γ的細(xì)胞比例有所下降,治療26周時(shí),IFN-γ產(chǎn)生細(xì)胞的比例降至正常水平。結(jié)果顯示,抗結(jié)核治療后隨著結(jié)核病變的好轉(zhuǎn),體內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌減少,抗原刺激減弱,抗原特異性T淋巴細(xì)胞隨之減少。因此,考慮FCM檢測(cè)治療前后細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)變化可對(duì)患者的治療療效有提示作用。4.結(jié)核性胸液的免疫檢測(cè)胸腔積液中的單個(gè)核細(xì)胞(pleuraleffusionmononuclearcells,PEMC)數(shù)量顯著高于PBMC數(shù)量,甚至可以達(dá)到PBMC的15倍,故理論上認(rèn)為對(duì)感染局部進(jìn)行抗原特異性T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)有可能獲得更高的敏感性,因此,結(jié)核性胸液的各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)較全血更有意義。Lee等應(yīng)用流式技術(shù)檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞因子診斷結(jié)核性胸腔積液的敏感性為91%。杜鳳嬌等應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)核性胸水中PEMC經(jīng)ESAT-6/CFP-10融合蛋白刺激后抗原特異性TH1百分比診斷結(jié)核性胸水的敏感性為87.5%,特異度為90.0%。與同時(shí)進(jìn)行的ELISPOT技術(shù)檢測(cè)的診斷敏感性和特異性水平相當(dāng)。因此,應(yīng)用流式技術(shù)檢測(cè)抗原特異性細(xì)胞因子可用于結(jié)核性胸膜炎的診斷中,尤其對(duì)相關(guān)檢查結(jié)果不特異的患者可提供重要幫助。5.細(xì)胞因子的檢測(cè)李麗等對(duì)結(jié)核性胸腔積液PEMC檢測(cè)ESAT-6抗原刺激后,依據(jù)CD4+T細(xì)胞分泌TH1型細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-2的不同組合,其中TNF-α單陽性細(xì)胞的比例最高,其次為Th1細(xì)胞(IFN-γ+TNF-α+IL-2+),即胸液中存在相當(dāng)比例的Th1細(xì)胞,其不僅分泌細(xì)胞因子種類最多,且分泌細(xì)胞因子的量也明顯高于其他亞群,因此很可能在局部結(jié)核控制中發(fā)揮重要的保護(hù)效應(yīng)。Qiao等應(yīng)用EAST-6和CFP-10作為抗原,檢測(cè)刺激結(jié)核性胸液中PEMCIFN-γ、IL-17和IL-22,結(jié)果顯示,IFN-γ、IL-17均得到高表達(dá),以IFN-γ高表達(dá)占明顯優(yōu)勢(shì)。因流式方法可同時(shí)檢測(cè)幾種細(xì)胞因子,因此,在對(duì)細(xì)胞因子功能檢測(cè)方面有重要作用。胥萍等研究發(fā)現(xiàn),初治肺結(jié)核患者外周血中CD4+IFN-γ+水平均顯著低于健康對(duì)照組,CD4+IL-4+水平則顯著高于健康對(duì)照組。粟粒性肺結(jié)核患者外周血中Thl細(xì)胞含量顯著低于繼發(fā)性肺結(jié)核患者,Th2水平顯著高于繼發(fā)性性肺結(jié)核和結(jié)核性胸膜炎。CD4+/CD3+T比例在3種結(jié)核病程中均呈下降趨勢(shì),且粟粒性肺結(jié)核顯著低于繼發(fā)性肺結(jié)核。提示不同類型結(jié)核病患者均存在不同程度的免疫功能減低,對(duì)Th1、Th2水平與CD4+/CD3+測(cè)定可助于臨床病情的判斷和療效觀察。6.cd27通過了pd-pcr和cfp-10在耐藥理關(guān)于結(jié)核感染的診斷目前已有較為公認(rèn)的診斷指標(biāo),如T-SPOT-TB方法,但活動(dòng)性結(jié)核病與結(jié)核感染目前尚無明確的鑒別診斷指標(biāo)。研究顯示,活動(dòng)性結(jié)核患者IFN-γ+CD4+T細(xì)胞多為CD27-細(xì)胞,提示在活動(dòng)性結(jié)核病中,CD27-細(xì)胞可能為活動(dòng)性結(jié)核病的診斷提供幫助。一項(xiàng)大鼠肺結(jié)核模型的實(shí)驗(yàn)對(duì)此也做了進(jìn)一步驗(yàn)證,提示CD27可能為活動(dòng)性結(jié)核和結(jié)核感染或非結(jié)核患者的鑒別提供幫助。Sargentini等以PPD和ESAT-6/CFP-10作為抗原,應(yīng)用流式技術(shù)檢測(cè)活動(dòng)性結(jié)核病、結(jié)核潛伏感染和健康志愿者PBMC抗原刺激后細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17,結(jié)果顯示,潛伏結(jié)核感染患者的IL-2分泌較活動(dòng)性結(jié)核患者升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意