變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型鼻黏膜重塑的研究

變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型鼻黏膜重塑的研究

哮喘和慢性阻塞性肺病的主要特征是呼吸道粘膜的不可逆轉(zhuǎn)化，包括典型的組織和功能變化，如表皮破壞和鈣化、腺體增生、平滑肌病、，高反應(yīng)性呼吸。目前,這種重塑改變?cè)谂R床上缺乏有效的預(yù)防和干預(yù)措施。變應(yīng)性鼻炎和哮喘在流行病學(xué)、病原學(xué)、臨床特征、免疫學(xué)、病理生理學(xué)、疾病轉(zhuǎn)歸等方面都被認(rèn)為是“同一氣道,同一疾病”。諸多學(xué)者從上、下氣道炎癥相關(guān)性研究鼻腔炎癥對(duì)上、下呼吸道重塑的影響。鼻黏膜細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)缺乏平滑肌成分,因此,鼻黏膜重塑特征有別與下呼吸黏膜的重塑特征。本研究主要通過變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型在變應(yīng)原長(zhǎng)期刺激作用下,動(dòng)態(tài)觀察鼻黏膜的病理變化,揭示變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜的重塑特征,從而為呼吸道黏膜炎癥一致性以及鼻腔炎癥干預(yù)對(duì)下氣道重塑的影響提供理論依據(jù)。1材料和方法1.17年7月健康成年Hartley雄性豚鼠48只,體重250～350g,由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供[SYXK(軍)2007-029]。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為6組,每組8只,實(shí)驗(yàn)組用卵清蛋白(OVA)激發(fā),分為3組:OVA2W組(2周抗原激發(fā)組)、OVA6W組(6周抗原激發(fā)組)、OVA12W組(12周抗原激發(fā)組);各組設(shè)立生理鹽水對(duì)照組(Sal2W組、Sal6W組、Sal12W組),所有實(shí)驗(yàn)步驟符合南京軍區(qū)南京總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。1.2離子蛋白及elisa試驗(yàn)劑OVA(V級(jí),Sigma),OVA特異性免疫球蛋白(OVA-sIgE)ELISA試劑盒和嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophicationicprotein,ECP)及ELISA試劑盒均購自Rapidbio公司。兔抗鼠TGF-β1抗體(1∶30,SantaCruz),生物素化山羊抗兔IgG工作液(二抗,武漢博士德)。Olympus醫(yī)學(xué)顯微鏡及多功能真色彩病理圖像分析系統(tǒng)(南京大學(xué)圖像中心)。1.3小鼠基礎(chǔ)致敏試驗(yàn)變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型參照文獻(xiàn)制作:①基礎(chǔ)致敏(第1～13天):每只動(dòng)物以0.3mgOVA作為致敏原,氫氧化鋁30mg作為佐劑,生理鹽水溶解形成1ml混懸液腹腔內(nèi)注射基礎(chǔ)致敏,隔日1次,連續(xù)7次;②強(qiáng)化致敏(第14～18天):以0.25%OVA生理鹽水溶液2ml超聲霧化吸入,每日1次,連續(xù)5d,強(qiáng)化致敏;③滴鼻激發(fā):間歇1周(第19～25天),從第26天開始,以2%OVA生理鹽水溶液0.1ml滴鼻激發(fā)。OVA2W組持續(xù)滴鼻2周,OVA6W組為間斷滴鼻6周,OVA12W組為間斷滴鼻12周。各組每周3次以2%OVA0.1ml滴鼻激發(fā)。以上步驟對(duì)照組均以生理鹽水代替OVA,其余與實(shí)驗(yàn)組相同。1.4鼻黏膜的檢測(cè)各組動(dòng)物均在最后一次滴鼻激發(fā)后24h,腹腔注射1%水合氯醛溶液麻醉。鼻腔灌洗:參考文獻(xiàn)的方法,取2ml經(jīng)37℃水浴箱預(yù)熱的PBS液經(jīng)氣管插管向動(dòng)物鼻部灌洗(1ml/min),反復(fù)3次,鼻部下方收集灌洗液。將收集好的鼻腔灌洗液離心,收集的上清移至另一干凈Eppendorf管中,-20℃保存,準(zhǔn)備測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。將豚鼠斷頭并去除皮膚,將連同鼻腔的上頜骨用4%中性甲醛固定、石蠟包埋。做3μm厚連續(xù)切片,行蘇木精-伊紅染色,觀察鼻黏膜上皮的損傷情況。采用AB-PAS染色,計(jì)數(shù)鼻黏膜單位面積上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞數(shù)。采用MT法染色,測(cè)定鼻黏膜基膜區(qū)膠原成分染色的面積百分率,每只動(dòng)物取組織完整和染色良好的4張切片,光學(xué)顯微鏡下觀察(每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野,取平均值),行組織病理學(xué)分析。1.5小鼠鼻黏膜免疫后抗體的檢測(cè)鼻黏膜組織轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)免疫組織化學(xué)檢測(cè):鼻黏膜石蠟切片,分別滴加一抗(兔抗鼠TGF-β1抗體)、二抗(生物素化山羊抗兔IgG)工作液,DAB顯色,蘇木精復(fù)染細(xì)胞核。1.6鼻干洗溶液中的炎癥指標(biāo)測(cè)定OVA-sIgE、ECP含量用ELISA法檢測(cè),步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。1.7基膜暴露整株理念鼻黏膜切片蘇木精-伊紅染色,按上皮細(xì)胞的狀態(tài)分4級(jí),0級(jí):纖毛上皮無損傷,纖毛完整;1級(jí):纖毛缺失,無上皮細(xì)胞剝脫;2級(jí):上皮細(xì)胞剝脫但未至基膜;3級(jí):上皮細(xì)胞全部剝脫,基膜暴露。測(cè)定各狀態(tài)下上皮細(xì)胞所占鼻黏膜面積的百分率,測(cè)定方法:高倍鏡下(×400)以各級(jí)上皮細(xì)胞所占基膜總長(zhǎng)的百分率表示。1.8組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及比較應(yīng)用SPSS13.0軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用xˉ±sxˉ±s表示,率的比較用χ2檢驗(yàn),組間比較用方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1鼻清洗中ecp和ova-sig含量的測(cè)定鼻灌洗液中ECP、OVA-sIgE含量的測(cè)定見表1。2.2鼻粘膜重建的評(píng)估2.2.1抗原刺激時(shí)間對(duì)皮質(zhì)組織病理學(xué)的影響實(shí)驗(yàn)組鼻黏膜上皮細(xì)胞損傷以1級(jí)為主,有不同程度的2級(jí)以上損傷;對(duì)照組幾乎無2級(jí)和3級(jí)上皮損傷。實(shí)驗(yàn)組早期上皮細(xì)胞水腫,隨著抗原刺激時(shí)間延長(zhǎng),黏膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)鱗化,上皮細(xì)胞增生明顯,上皮排列失去極性,嗜酸粒細(xì)胞(EOS)浸潤(rùn)隨抗原刺激時(shí)間延長(zhǎng)有增多趨勢(shì)。2組鼻黏膜上皮細(xì)胞損傷程度的比較見表2。2.2.2鼻中隔黏膜單位面積生物量的檢測(cè)鼻黏膜石蠟切片AB-PBS染色腺體中糖原顆粒呈紅色反應(yīng),以此作為杯狀細(xì)胞計(jì)數(shù)。鼻黏膜中腺體隨著抗原刺激時(shí)間延長(zhǎng)明顯肥大、增生,上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞肥大、增生,尤其在下鼻甲黏膜內(nèi)更加明顯(圖1)。高倍鏡下(×400)記數(shù)鼻中隔黏膜單位面積上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mm2),OVA2W、OVA6W、OVA12W組分別為27.4±41.7、71.2±6.8、95.2±14.1,與OVA2W組比較,其他2組的杯狀細(xì)胞數(shù)明顯增多(均P<0.05)。Sal2W、Sal6W、Sal12W組杯狀細(xì)胞數(shù)分別為16.3±8.1、19.5±6.4、18.0±3.1,均較相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組明顯減少(均P<0.05)。2.2.3ecm膠原沉積鼻黏膜石蠟切片MT染色膠原呈藍(lán)色,作為ECM成分的標(biāo)志?？梢娔z原成分沉積于黏膜基膜及腺體、血管周圍(圖2)。高倍視野下測(cè)量鼻黏膜基膜區(qū)下20μm厚度范圍內(nèi)MT染色藍(lán)色面積所占的百分率。OVA2W、OVA6W、OVA12W組ECM膠原沉積分別為(18.6±12.0)%、(22.9±9.3)%、(21.7±1.3)%,與OVA2W組比較,其他2組ECM膠原沉積明顯增多(均P<0.05)。Sal2W、Sal6W、Sal12W組ECM膠原沉積分別為(15.6±4.0)%、(13.5±2.5)%、(14.5±1.5)%,后2組ECM膠原沉積均較相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組明顯減少(均P<0.05)。2.3濃度對(duì)陽性染色細(xì)胞顆粒的影響TGF-β1主要表達(dá)在鼻黏膜基膜、腺體及血管周圍的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì),少量表達(dá)在黏膜上皮細(xì)胞及炎性細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì),均呈棕黃色顆粒(圖3)。計(jì)算鼻黏膜基膜區(qū)下20μm厚度中陽性染色細(xì)胞的程度,通過圖像分析,結(jié)果用吸收度(A值)表示,A值越大,陽性染色細(xì)胞顆粒越多。OVA2W、OVA6W、OVA12W組A值分別為0.271±0.083、0.307±0.008、0.395±0.027,與OVA2W組比較,其他2組的A值明顯增大(均P<0.01)。Sal2W、Sal6W、Sal12W組A值分別為0.225±0.090、0.238±0.026、0.203±0.041,與相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。3干預(yù)措施缺乏有效干預(yù)支氣管哮喘導(dǎo)致下氣道重塑改變是引起慢性阻塞性肺病的重要原因,這種重塑改變目前尚缺乏有效的干預(yù)策略。而變應(yīng)性鼻炎同支氣管哮喘有類似的病理過程,因此變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜重塑的機(jī)制以及對(duì)下呼吸道影響和下呼吸道重塑的相關(guān)性研究成為近年來的研究熱點(diǎn)。3.1鼻灌洗液中ova-sige和ecp含量的檢測(cè)IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)和EOS致鼻黏膜慢性持續(xù)性炎癥是變應(yīng)性鼻炎的2個(gè)重要特點(diǎn)。EOS活化釋放其細(xì)胞內(nèi)的活性顆粒,導(dǎo)致組織炎癥。本研究通過檢測(cè)鼻灌洗液中OVA-sIgE、ECP的含量來評(píng)價(jià)變應(yīng)性鼻炎豚鼠模型。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組鼻灌洗液中OVA-sIgE的含量組間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);同時(shí)在實(shí)驗(yàn)組中,同OVA2W組比較,OVA6W和OVA12W組的OVA-sIgE含量呈降低趨勢(shì)。與Palmans等在氣道過敏的BN鼠模型中測(cè)得的血清OVA-sIgE含量的結(jié)果類似。3.2變應(yīng)性麻黃性鼻黏膜的基因特征下呼吸道重塑的特征性病理改變?yōu)轲つど掀p傷、支氣管壁增厚、腺體肥大、基膜上膠原沉積、平滑肌數(shù)量和纖維生長(zhǎng)因子增加以及氣道高反應(yīng)性。但鼻黏膜的ECM缺乏平滑肌成分,因此上氣道是否存在類似的重塑現(xiàn)象仍存有爭(zhēng)議。上皮細(xì)胞損傷是組織重塑的特點(diǎn)之一。Amin等指出,與健康人相比,變應(yīng)性鼻炎患者的鼻黏膜上皮有脫落,而同一患者在過敏季節(jié)和非過敏季節(jié)的比較中均有上皮脫落現(xiàn)象。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)上皮連接緊密度與EOS聚集程度相關(guān)。本研究對(duì)照組鼻黏膜僅有少量纖毛的改變,幾乎無2級(jí)以上的上皮損傷;實(shí)驗(yàn)組隨著抗原刺激時(shí)間延長(zhǎng),上皮損傷明顯,0級(jí)和1級(jí)上皮損傷有顯著差異,但2級(jí)以上損傷差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能和組織與標(biāo)本取材、實(shí)驗(yàn)技術(shù)有關(guān)。因此對(duì)于長(zhǎng)期抗原刺激,上皮損傷是存在的,尤其是1級(jí)以上的上皮損傷,基膜暴露,導(dǎo)致EGF、TGF-β1等生長(zhǎng)因子激活,從而啟動(dòng)重塑進(jìn)程。鼻黏膜腺體主要包括位于基膜的具有單細(xì)胞分泌功能的杯狀細(xì)胞以及位于固有層的黏液腺。Gluck等的研究結(jié)果表明,花粉癥患者在過敏季節(jié)鼻分泌物涂片中杯狀細(xì)胞明顯增多。更多研究也表明變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜腺體除了數(shù)量的變化,其結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化。黏膜重塑另一重要特征是基膜膠原沉積。由于鼻黏膜缺乏平滑肌成分,因此基膜膠原纖維沉積是鼻黏膜重塑研究的焦點(diǎn)。因此本研究用MT染色觀察鼻黏膜基膜以下20μm厚范圍內(nèi)膠原的相對(duì)含量。結(jié)果表明,在早期膠原沉積并不明顯,但隨著抗原刺激延長(zhǎng),在6W和12W組,基膜藍(lán)染的百分率明顯增加。這一結(jié)果與Braunstahl等報(bào)告的變應(yīng)性鼻炎鼻黏膜基膜下的膠原層增厚結(jié)論相一致。但Sanai等的研究結(jié)果顯示,在變應(yīng)性鼻炎和非變應(yīng)性性鼻炎患者的鼻黏膜中膠原總量無明顯差別,但在膠原的組分上卻存在明顯差異,常年變應(yīng)性鼻炎患者鼻黏膜Ⅰ型和Ⅲ型膠原總量增加,并且鼻黏膜中TGF陽性染色細(xì)胞數(shù)量與這種變化有相關(guān)性。TGF-β1參與細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、血管形成、腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移等多種生理、病理過程。氣道中TGF-β1表達(dá)增高,能刺激氣道平滑肌細(xì)胞分裂與增殖,導(dǎo)致平滑肌增生和肥厚。因此本研究進(jìn)一步用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)與基膜膠原沉積有密切相關(guān)的細(xì)胞因子TGF-β1。結(jié)果表明,TGF-β1主要表達(dá)在基膜纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞、血管和腺體的纖維細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中。TGF-β1在抗原刺激早期(2w),盡管在宏觀上膠原合成尚未明顯增加,但從微觀上檢測(cè),此時(shí)各種生長(zhǎng)因子的表達(dá)已開始上調(diào),與膠原合成有關(guān)的酶活性已經(jīng)明顯增