高效液相-核磁共振聯(lián)用技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用

PAGEPAGE1頁眉頁腳藥物分析綜述題目：液相—核磁共振聯(lián)用技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用組員姓名：黃志華、竇文淵、彭啟柏所在學院：藥科學院 專業(yè)班級：藥學05（5）班 學號：0503501564、0503501565、0503501535日期：2008-6-2液相—核磁共振聯(lián)用技術(shù)在中藥分析中的應(yīng)用摘要:HPLC一NMR聯(lián)用技術(shù)是一種高效、快速獲得混合物中未知化合物結(jié)構(gòu)信息的術(shù)，近年來，它在藥物研究中的應(yīng)用日益廣泛。本文介紹了HPLC一NMR聯(lián)用技術(shù)及其在中藥分析中分離、結(jié)構(gòu)鑒定、構(gòu)型分析等方面的一些研究應(yīng)用。關(guān)鍵詞:液相—核磁共振聯(lián)用技術(shù)(LC－NMR)中藥分析中藥是中華民族的瑰寶，數(shù)千年來，中藥對中國人民的醫(yī)療保健發(fā)揮了巨大的作用特別是隨著我國加入世界貿(mào)易組織后，以仿制為主的西藥研制將遇到嚴重挑戰(zhàn)，中藥己成為我國最有優(yōu)勢的研究與開發(fā)領(lǐng)域。充分利用現(xiàn)代科學技術(shù)的方法和手段，按照國際認可的醫(yī)藥標準規(guī)范，研究開發(fā)能夠正式進入國際醫(yī)藥市場的中藥產(chǎn)品，推動中藥的現(xiàn)代化，不僅具有經(jīng)濟效益也具有巨大的社會效益。在這其中，中藥及其復(fù)方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究是中藥現(xiàn)代化研究的重點與突破口，它關(guān)系到藥材、飲片，中藥制劑和中成藥產(chǎn)品等的質(zhì)量控制等。中藥的真?zhèn)舞b別和品質(zhì)評價是臨床應(yīng)用、成藥制備、中藥科研不可缺少的前提條件。我國藥材品種繁多，存在南北差異、同名異物、同物異名等情況，混淆品極多，療效也各不相同。而且中藥的有效成分和環(huán)境、產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素也有很大關(guān)系。加之近年來，假冒偽劣中藥充斥市場，為控制中藥質(zhì)量、保證臨床用藥安全和有效，需要對中藥進行嚴格鑒定。隨著科技不斷發(fā)展，從最原始的眼觀、鼻聞、口嘗、手摸到顯微鑒別和理化鑒別，再到光譜、色譜等現(xiàn)代技術(shù)的應(yīng)用，中藥鑒定技術(shù)越來越多元化。但每一種分析技術(shù)均有其適用范圍和局限性，將單一的分析技術(shù)聯(lián)合起來，不僅能獲得更多的信息，而且可能產(chǎn)生單一分析技術(shù)所無法得到的新的信息。因此，聯(lián)用技術(shù)已成為中藥鑒定發(fā)展的一個重要方向。HPLC雖然是復(fù)雜成分的分離中最有力的工具，微處理機的應(yīng)用，簡化了儀器操作，并能夠?qū)崿F(xiàn)全自動化，應(yīng)用極為廣，通過UV可變波長檢測器，可獲得一些化合物的附加信息，但信息量非常有限，對活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定幫助不大。NMR能夠提供大量的結(jié)構(gòu)信息，包括立體化學信息(在某些情況下，它不需其他光譜的信息，就能解析未知物的結(jié)構(gòu))。因此NMR對中藥中活性成分的結(jié)構(gòu)鑒定有很大的幫助。毫無疑問，HPLC－NMR聯(lián)用技術(shù)對中藥的分析研究中活性成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定的速度將大大提高。以下對HPLC—NMR聯(lián)用技術(shù)操作及在中藥中的分析應(yīng)用作簡單的介紹。1.HPLC—NMR聯(lián)用技術(shù)HPLC—NMR聯(lián)用技術(shù)的研究開始于20世紀70年代,早期發(fā)展十分緩慢，主要是因為當時NMR儀的靈敏度還較低，溶劑峰抑制問題也尚未解決。近年來HPLC-NMR聯(lián)用技術(shù)的迅速發(fā)展得益于NMR波譜儀磁場強度的提高、HPLC—NMR專用探頭的設(shè)計及溶劑峰抑制技術(shù)的發(fā)展，從而解決了動態(tài)變化、靈敏度及溶劑抑制(尤其是梯度系統(tǒng))的問題。當時該儀器可采用停止流動模式,隨后不久連續(xù)流動模式打通,從此以后,隨著儀器設(shè)計、磁場強度、流動探頭等方面研制水平的提高與改進,以及有效的壓制溶劑峰的脈沖序列的建立,使得這項技術(shù)現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用到實際工作中。1.1基本操作模式LC－NMR聯(lián)用技術(shù)主要有三種操作模式:連續(xù)流動操作模式、停流操作模式和峰存貯操作模式。1.1.1連續(xù)流動（on-flow）操作模式:樣品由HPLC常規(guī)檢測器（UV等）出口，用毛細管直接連接到專用NMR探頭的液槽，毛細管的長度為2m。隨著分離連續(xù)獲得NMR圖譜，一次分析可得到所有組分的NMR信息，然而由于樣品溶液濃度低，NMR采樣時間短（通常掃描16次），很難得到分辨率良好的NMR圖譜。1.1.2停流(stop-flow)操作模式：當樣品色譜峰最高點到達NMR液槽的中心位置時，停止流動，進行一維或二維NMR采樣，直至獲得良好的NMR圖譜。然后再啟動輸液，恢復(fù)正常HPLC條件，繼續(xù)下一色譜峰的NMR測定。在出峰時停泵，可以獲得較好的NMR圖譜。1.1.3峰存貯操作模式：當欲分析組分較多而各組分的含量較低時，為避免由于多次暫停LC分離而帶來峰擴散現(xiàn)象，可采用峰存貯操作模式。正常色譜分離時當UV檢測到色譜峰時將流出物收集并暫時貯存到不同的毛細管回路內(nèi)，由NMR譜儀逐一離線測定各流分。該模式下的樣品需要量低于停流操作。這樣既不中斷HPLC過程，又能獲得全部成分的良好的NMR圖譜。除用毛細管回路貯存色譜成分外，還有小柱截留法。1.2溶劑峰抑制方法大多數(shù)HPLC體系采用反相柱,使用2種或3種溶劑的混合物作洗脫液,除D2O外,其它氘代溶劑作為常規(guī)洗脫液太昂貴。因此,在線反相HPLC-NMR實驗中常采用含質(zhì)子的溶劑,如CH3CN和CH3OH等。常用的MeOH-H2O和MeCN-H2O體系在NMR中有很強的響應(yīng)值,可能掩蓋分析對象。為了消除NMR波譜儀接收器的動態(tài)范圍問題,溶劑質(zhì)子信號必須加以抑制,常用的方法有:(1)采用氘代溶劑,但價格昂貴,適合于μHPLC。(2)通過不同頻率通道進行多重溶劑峰預(yù)飽和。(3)脈沖梯度場的相位離散而消除溶劑干擾。近年來由于毛細管HPLC的發(fā)展,溶劑的消耗量大為減少,在實驗中有可能完全使用氘代試劑作洗脫液,不必使用溶劑抑制。1.3靈敏度的提高提高HPLC-NMR靈敏度的方法有:(1)利用SPE等方法濃縮樣品。要得到高分辯的譜圖,溶液中不能有懸浮的灰塵和纖維。一般情況下用棉花和濾紙把樣品直接過濾到樣品管中。測試微量樣品時,要帶手套處理樣品,以防手指上的微量物質(zhì)溶在溶液中,否則1H譜中δ1.4會出現(xiàn)一個7Hz裂分的雙峰,δ4還有一個四重峰,可能來自丙氨酸或乳酸。(2)提高磁場強度(900MHzNMR已經(jīng)商品化)。核磁譜儀場強的不斷升高,從某種程度上增加了NMR的靈敏度和分辯力.從1987年第一臺600MHz的NMR儀,到現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到900MHz了。(3)降低探頭溫度(商品化的低溫探頭)。利用高溫超導薄膜材料而制成的超導低溫探頭,當樣品溫度由溫控單元維持時,采用閉環(huán)或開環(huán)制冷系統(tǒng)使超導線圈溫度降到25K,消除了譜圖的電噪聲,相對常規(guī)5mm探頭而言,其潛在靈敏度可以提高8～10倍。國內(nèi)已有此類探頭使用,500MHz信噪比達3200∶1,可達到800MHz水平。2.HPLC—NMR在中藥分析中的應(yīng)用2.1HPLC—NMR聯(lián)用技術(shù)在檢測植物藥有效成分中的應(yīng)用2.1.1半夏水提取物中的應(yīng)用陳平、梁世瓢等利用HPLC—NMR對半夏水提取物中8種化合物的結(jié)構(gòu)進行分析.他們采用Loop-collection（環(huán)收集方式）的工作方式，將液相分離后不同組分分別收集在不同餾分收集環(huán)(Loop)里，然后逐個注入流動探頭，再根據(jù)化合物濃度不同,進行不同采樣時間的核磁共振檢測，根據(jù)需要增加低濃度樣品的核磁采樣時間。由實驗結(jié)果分析而得半夏水提取物中的8種化合物分別是胞昔、酪氨酸、尿普、腺喋吟、鳥營、苯丙氨酸、腺營和色氨酸(Figure2-6)。實驗過程中被測組分從loop中進入NMR分析，在數(shù)據(jù)采集前必須利用溶劑抑制技術(shù)去除流動相產(chǎn)生的巨大的共振信號的干擾。使用溶劑抑制技術(shù)帶來的一個問題是如果被測化合物的NMR共振信號恰好在溶劑峰包埋之下，則這些信號將與溶劑信號一樣被壓掉。當被測化合物是未知化合物時，這些信號的缺失將會嚴重。2.1.2對蛇葡萄根的化學成分的研究王映紅、李娜等通過用HPLC—NMR儀對葡萄科蛇葡萄根的化學成分進行研究。在INOVA－2500LC－NMR上,用停止流動的方法采集LC－NMR1H－NMR譜及WEGCOSY譜.進樣量為25μL,1H－NMR譜采樣時間為1.5s,累加次數(shù)為416。WETG2COSY的F1,F2均為60000.0Hz,nt=24,ni=128,總采樣時間為1h7min37。由結(jié)果鑒定出其中主要成分的結(jié)構(gòu)為一－白藜蘆醇四聚體VitisinB。2.1.3對長葉框樹中的木脂素類化合物的分析Zhao等用停止流動HPLC-NMR鑒別了紫杉科植物長葉框樹中的木脂素類化合物。長葉框樹針葉樣品經(jīng)提取、固相提取等預(yù)精制后，以梯度洗脫HPLC分得8個化合物峰，通過停止流動方法記錄1H－NMR譜，再結(jié)合EI-MS等對其中7個化合物作了結(jié)構(gòu)研究。峰1-6分別為化合物絡(luò)石昔元、去甲絡(luò)石糖昔元、牛芬昔元、歐側(cè)柏內(nèi)醋甲基醚、松脂素和甲基松脂素。峰7的HPLC-1HNMR譜與1-6的不同，提示為一個新木脂素型化合物。峰8通過HPLC－NMR測定，表明是一個未知結(jié)構(gòu)的非木脂素類化合物。2.1.4對棕櫚油提取物的分析StrohscheinL等以C30HPLC－NMR聯(lián)用研究了富含維生素E同系物的粗棕櫚油提取物。通過對圖譜分析分離、鑒定去粗棕櫚油提取物中有δ一和γ-型生育三烯酚、β－型生育三烯、a一生育三烯酚、a一生育酚、a一生育烯酚。本方法用甲醇作為流動相而不需加緩沖液的色譜條件對聯(lián)用技術(shù)來說是理想的。2.1.5山藍色素前體分子組成與化學變化的研究謝運昌、文永新等用HPLC－NMR聯(lián)用技術(shù)研究山藍中山藍色素前體的分子組成與化學變化，由分析1H—NMR圖譜表明山藍色素前體分子有由2個紫藍氨酸殘基和1個氨基酚殘基鍵合而成的片段，在室溫下放置后，氨基酚結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)轷Y(jié)構(gòu)。研究結(jié)果為山藍色素前體、山藍色素及其相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)測定提供了重要數(shù)據(jù)為山藍色素的化學、山藍色素形成機理的闡明起到了關(guān)鍵作用。2.1.6LC一NMR聯(lián)用技術(shù)分析黃連中微量生物堿的研究王愛國、馮幸章等運用INVOA500LC一NMR聯(lián)用儀對黃連中微量生物堿進行LC一NMR研究，分別測定幾個微量成分的1H—NMR，根據(jù)LC一NMR分析，推定黃連總堿中幾個微量成分為化合物(1)為5一羥基一13一甲基小檗堿；化合物(2)為5-羥基一棕櫚堿；化合物(3)為13一甲基小檗堿；化合物(4)為棕櫚堿，該研究對黃連成分的研究有重要的指導意義。2.2HPLC—NMR對雙氫青蒿素差向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化的研究劉寧、楊臘虎等通過HPLC—NMR儀對雙氫青蒿素進行分離和測定。在HPLC色譜條件下所分離而得的2個異構(gòu)體以工作頻率為500MHz的NMR儀進行分析,用氘代甲醇為溶劑,并兼作化學位移內(nèi)標,在室溫下對溶解在氘代甲醇30min后和異構(gòu)體轉(zhuǎn)化平衡時進行氫譜檢測。在對實驗初期和放置一段時間后的1H—NMR圖譜比較,在1H—NMR圖譜中明顯一個峰位高低轉(zhuǎn)化的過程,說明雙氫青蒿素在溶液中存在異構(gòu)體的轉(zhuǎn)化過程。并由圖譜得出2個異構(gòu)體的1H—NMR圖譜主要在5位－H于12位－H化學位移δ值有明顯的差異。2.3LC-NMR在用血清藥化學方法對單味中藥內(nèi)活性成分進行研究中的應(yīng)用楊春、梁曉天等以“血清藥物化學”方法為研究思路，用LC-NMR聯(lián)用技術(shù)對服用當歸后大鼠的血清樣品進行研究，分析其中的活性成分。用HPCL法在大鼠服藥后的血清中發(fā)現(xiàn)了5個當歸活性成分，在肝臟中發(fā)現(xiàn)8個當歸活性成分。用HPLC一NMR聯(lián)用技術(shù)對肝臟和血清中2個主要活性成分研究表明，它們?yōu)槟緝?nèi)酯和6，7一二羥基一3a，6，7，7a-四氫藁本內(nèi)酯。在服藥后大鼠的肝臟中，阿魏酸的含量最高，而6,7-二羥基-3a,6,7,7a-四氫藁本內(nèi)酯的含量比藁本內(nèi)酯高。在血清中，6,7-二羥基-3a,6,7,7a-四氫藁本內(nèi)酯的含量最高，而藁本內(nèi)酯的含量較低，未發(fā)現(xiàn)阿魏酸。在大鼠服藥后1.Oh的肝臟中發(fā)現(xiàn)阿魏酸的含量最高，而藁苯類化合物的含量并不高。這可能由于阿魏酸的水溶性大，而藁苯類為脂溶性化合物，因此阿魏酸在體內(nèi)吸收較好。但在1.Oh的血液中并未發(fā)現(xiàn)它的存在，可能其代謝較快。由于體內(nèi)生物樣品中的活性成分來源于中藥，在排除代謝產(chǎn)生的成分后，通過對中藥中相應(yīng)成分的檢測，可知中藥在體內(nèi)的活性成分，這為中藥的研究提供了一種新的思路?？偨Y(jié)實踐證明HPLC－NMR在結(jié)構(gòu)具有規(guī)律性的同類化合物的鑒定中,可起到提高工作效率、避免盲目重復(fù)勞動的作用.在中藥分析的提取分離工作中不但有指導作用,還可以提供較為準確的光譜信息,排除雜質(zhì)的干擾,大大降低了中藥中混合物結(jié)構(gòu)分析的難度，從而可以確定其結(jié)構(gòu)和立體構(gòu)型。在過去幾年里，雖然HPLC－NMR聯(lián)用技術(shù)的靈敏度已大大提高，并在分離和鑒定上有了一些成功的應(yīng)用，但仍不夠滿意，柱與池間以及池本身造成的峰擴散需進一步降低。不斷提高NMR的靈敏度和色譜光譜分辨能力，使得實驗結(jié)果更準確可靠。參考文獻1.劉文英《藥物分析第6版》人民衛(wèi)生出版社；2.徐蘇麗聯(lián)用技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用海峽藥學2007年第19卷第6期；3.張亮，張正行HPLC/NMR聯(lián)用技術(shù)及其在藥物分析中的應(yīng)用國外醫(yī)學藥學分冊1991年第18卷第4期；4.陳平，梁世瓢，李川，宋國強液核聯(lián)用(LC/NMR)與液質(zhì)聯(lián)用(LCIMS)的結(jié)合用于中藥多成分化學結(jié)構(gòu)的分析(該分析技術(shù)平臺的建立及其在分析半夏水提物中的應(yīng)用)中國藥學會學術(shù)年會論文集2002:742-744；5.王映紅,李娜,賀文義等高效液相2核磁共振儀聯(lián)用技術(shù)及微量探頭技術(shù)在天然產(chǎn)物分析中的應(yīng)用波譜學雜志2002年9月第19卷第3期；6.靳朝東色譜聯(lián)用技術(shù)在檢測植物藥有效成分中的應(yīng)用國外醫(yī)藥·植物藥分冊2002年第17卷第4期；7.謝運昌，文永新，蔣小華等山藍色素前體分子組成與化學變化廣西植物Guihaia23（4）：367－3692003年7月；8.王愛國，馮幸章，李立軍等千金黃連丸加味治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)研究—利用LC一MS/MS及LC一NMR聯(lián)用技術(shù)分析黃連中微量生物堿分析測試學報2001Vol.20No.z1P.63-64；9.劉寧，楊臘虎，張正行，俞如英雙氫青蒿素差向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化的研究藥物分析雜志22（4），2002；10.楊春核磁共振技術(shù)在藥物研究復(fù)雜體系中的應(yīng)用博士學位論文中國協(xié)和醫(yī)科大學2001年5月；1