免疫學實驗凝集試驗

實驗一凝集實驗顆粒性抗原(細菌、螺旋體、紅細胞等)與對應抗體結(jié)合后，在有適量電解質(zhì)存在下，抗原顆?？苫ハ嗄扇庋劭梢姷哪瘔K，稱為凝集反映(Agglutinationreaction)或凝集實驗。參加凝集反映的抗原稱為凝集原（Agglutinogen），抗體稱為凝集素（Agglutinin）。細菌或其它凝集原都帶有相似的負電荷，在懸液中互相排斥而呈現(xiàn)均勻的分散狀態(tài)?？乖c對應抗體相遇后能夠發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原抗體復合物，減少了抗原分子間的靜電排斥力，此時已有凝集的趨向，在電解質(zhì)（如生理鹽水）參加下，由于離子的作用，中和了抗原抗體復合物外面的大部分電荷，使之失去了彼此間的靜電排斥力，分子間互相吸引，凝集成大的絮片或顆粒，出現(xiàn)了肉眼可見的凝集反映。根據(jù)與否出現(xiàn)凝集反映及其程度，看待測抗原或待測抗體進行定性、定量測定。凝集反映涉及直接凝集反映和間接凝集反映兩大類，本實驗重要介紹直接凝集反映。[目的規(guī)定]1.掌握平板凝集實驗和試管凝集實驗的操作辦法。2.掌握凝集實驗的成果鑒定及鑒定原則。3.熟悉平板凝集實驗和試管凝集實驗所需材料和試劑。[材料與試劑]1.玻板，載玻片，試管（1cmx8cm），試管架，刻度吸管，滴管，微量可調(diào)加樣器，滴頭（tip頭），牙簽或火柴棒，記號筆。2.滅菌的生理鹽水，滅菌的0.5%石炭酸生理鹽水。3.布氏桿菌病試管凝集抗原，布氏桿菌病平板凝集抗原，布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原，布氏桿菌病陽性血清，布氏桿菌病陰性血清，被檢血清（牛、羊或豬）。4.雞白痢平板凝集抗原，雞白痢陽性血清，雞白痢陰性血清，被檢雞血清。[實驗內(nèi)容及操作辦法]（一）試管凝集實驗以牛布氏桿菌病試管凝集實驗為例。1.試管準備：每份血清用試管4支，另取3支試管作為對照，作好標記，置試管架上。如被檢血清有多份，對照只需做1份。2.被檢血清稀釋：第1管加入2.3ml0.5%石炭酸生理鹽水，第2、3、4管加入0.5ml0.5%石炭酸生理鹽水；然后用加樣器或刻度吸管吸取被檢血清0.2ml，加入第1管中，重復吹吸5次混勻，吸取1.5ml棄之，再吸取0.5ml加入第2管中，混勻后吸取0.5ml加入第3管，依這類推至第4管，混勻后吸棄0.5ml（見表1-1）。該被檢血清的稀釋度分別是1:12.5、1:25、1:50、1:100。3.對照管制作：第5管中加0.5%石炭酸生理鹽水0.5ml，第6管加1:25稀釋的布氏桿菌病陽性血清0.5ml，第7管加1:25稀釋的布氏桿菌病陰性血清0.5ml。4.加抗原：將布氏桿菌病試管凝集抗原用0.5%石炭酸生理鹽水作1:20稀釋，每支試管加0.5ml。表1-1布氏桿菌病試管凝集實驗術(shù)式表（單位：ml）試管號1234567對照管最后血清稀釋度1：251：501：1001：200抗原陽性血清陰性血清1：251：250.5%石炭酸生理鹽水2.30.50.50.50.5被檢血清0.20.50.50.50.50.5抗原(1：20)0.50.50.50.50.50.50.5棄1.5棄0.55.感作（反映）：7支試管加完抗原后，充足混勻，置于37℃溫箱中4-10h，取出后置室溫18-24h（或37℃溫箱12-14h，取出后置室溫2-4h；或6.成果鑒定：鑒定成果時用“+”表達反映的強度。根據(jù)各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集塊的形狀，來鑒定凝集反映的程度。＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完全透明，菌體完全被凝集呈傘狀沉于管底，振蕩時，沉淀物呈片狀、塊狀或顆粒狀。＋＋＋：75％抗原凝集，上清液略呈混濁，菌體大部分被凝集沉于管底，振蕩時狀況如上。（管底凝集物與100%凝集時相似，只是上清液稍渾濁）。＋＋：50％抗原凝集，上清液渾濁半透明，管底有中檔量的凝集物（管底有明顯的凝集）。＋：25％抗原凝集，上清液完全渾濁不透明，管底有少量凝集物或凝集的痕跡。－：抗原完全未凝集，上清液完全渾濁不透明，但由于菌體的自然下沉，在管底中央出現(xiàn)規(guī)則的菌體自沉圓點，振蕩后立刻散開呈均勻混濁。7.鑒定原則：能使50%抗原凝集的血清最高稀釋度稱為該血清的凝集價（或稱滴度）。牛、馬和駱駝的血清凝集價不不大于或等于1:100，判為陽性，1:50的凝集價判為疑似反映（可疑）；豬、綿羊、山羊和狗的血清凝集價不不大于或等于1:50，判為陽性，1:25的凝集價判為疑似反映（可疑）。[注意事項]1.實驗時必須設抗原、陽性血清及陰性血清對照，以避免假陽性、假陰性的成果。2.成果判為可疑時，隔2-3周后采血重做。陽性畜群，重檢時仍為可疑，可判為陽性。對同群中既無臨床癥狀又無凝集反映陽性者，馬、豬重檢仍為可疑，判陰性；牛、羊重檢仍為可疑者，可判為陽性，或以補體結(jié)合反映核對。（二）布氏桿菌病平板凝集實驗1.加血清：取干凈玻板一塊，用蠟筆劃成方格（4cm2），并注明被檢血清號碼，以100L微量可調(diào)加樣器按下列量加被檢血清于方格內(nèi)，第l格80L、第2格40L、第3格20L、第4格大規(guī)模檢疫時，允許只用兩個血清量作實驗，牛、馬、駱駝用40L和20L；豬、山羊、綿羊、狗用2.加抗原：每格加布氏桿菌病平板凝集抗原30抗原用前搖勻，并置室溫使其溫度達20℃3.作用：混和完畢后，將玻板置恒溫箱中或采用別的方法適宜加溫，使溫度達成30℃4.對照：每次實驗須用原則陽性血清和陰性血清以及生理鹽水作對照。5.成果鑒定：按下列原則統(tǒng)計反映成果。＋＋＋＋：出現(xiàn)大的凝集塊，液體完全透明，即100%凝集。＋＋＋：有明顯凝集塊，液體幾乎完全透明，即75%凝集。＋＋：有可見凝集塊，液體不甚透明，即50%凝集。＋：液體混濁，有小的顆粒狀物，即25%凝集。－：液體均勻混濁，無凝集現(xiàn)象。6.平板凝集實驗與試管凝集實驗的關(guān)系見表1-2。表1-2平板凝集實驗與試管凝集實驗的關(guān)系平板凝集80402010相稱于試管凝集1:251:501:1001:2007.鑒定原則：同試管凝集實驗。8.注意：對于陽性及可疑的被檢血清需用試管凝集實驗進行驗證。（三）虎紅平板凝集實驗這種實驗是快速平板凝集實驗?？乖遣际蠗U菌加虎紅制成?；⒓t平板凝集實驗可與試管凝集實驗及補體結(jié)合實驗效果相比，含有操作簡樸、快速、特異性強的優(yōu)點。1.被檢血清和布氏桿菌病虎紅平板凝集抗原各30L滴于玻璃板的方格內(nèi)，每份血清各用一支牙簽或火柴棒混合均勻。在室溫（202.成果鑒定：在陽性血清及陰性血清實驗成果對的的前提下，被檢血清出現(xiàn)任何程度的凝集現(xiàn)象均判為陽性，完全不凝集的判為陰性，無可疑反映。3.注意：抗原用前充足搖勻，抗原和被檢血清用前應放室溫30-60min后再進行實驗。（四）雞白痢平板凝集實驗1.被檢雞血清和雞白痢平板凝集抗原各1滴（約302.成果鑒定：在室溫（20℃[思考題]1.凝集反映的原理是什么?2.哪些因素影響細菌凝集實驗?3.凝集實驗中為什么要設陽性、陰性血清及抗原對照？

實驗二病毒的血凝及血凝克制實驗有些病毒含有凝集某種(些)動物紅細胞的能力，稱為病毒的血凝，運用這種特性設計的實驗稱血球凝集(HA)實驗，以此來推測被檢材料中有無病毒存在，是非特異性的，但病毒的凝集紅細胞的能力可被對應的特異性抗體所克制，即血球凝集克制(HI)實驗，含有特異性。通過HA-HI實驗，可用已知血清來鑒定未知病毒，也可用已知病毒來檢查被檢血清中的對應抗體和滴定抗體的含量。[目的規(guī)定]掌握病毒HA和HI實驗的原理和基本操作辦法，理解其實用價值。[材料與試劑]1.96孔“U”形或“V”形微量反映板，50L2.生理鹽水，0.5%雞紅細胞懸液。3.新城疫病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），新城疫陽性血清，被檢雞血清。[實驗內(nèi)容及操作辦法]（一）血球凝集(HA)實驗1.在96孔微量反映板上進行，自左至右各孔加502.于左側(cè)第1孔加50L病毒液（尿囊液或凍干疫苗液），混合均勻后，吸50L至第2孔，依次倍比稀釋至第11孔，吸棄503.自右至左依次向各孔加入0.5%雞紅細胞懸液50表4-1病毒血凝實驗的操作辦法（單位：L）孔號123456789101112病毒稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048對照生理鹽水505050505050505050505050病毒液50505050505050505050500.5%紅細胞505050505050505050505050棄50成果觀察+++++++++++++++++++++++++++++++++--4.成果鑒定：從靜置后10min開始觀察成果，待對照孔紅細胞已沉淀即可進行成果觀察。紅細胞全部凝集，沉于孔底，平鋪呈網(wǎng)狀，即為100%凝集（++++），不凝集者（-）紅細胞沉于孔底呈點狀。以100%凝集的病毒最大稀釋度為該病毒血凝價，即為一種凝集單位。從表4-1看出，該新城疫病毒液的血凝價為1:128，則l:128為1個血凝單位，1:64、l:32分別為2、4個血凝單位，或?qū)?28/4=32，即1:32稀釋的病毒液為4個血凝單位。(二)血球凝集克制(HI)實驗1.根據(jù)HA實驗成果，擬定病毒的血凝價，配制出4個血凝單位的病毒液。2.在96孔微量反映板上進行，用固定病毒稀釋血清的辦法，自第1孔至第11孔各加503.第１孔加被檢雞血清50L，吹吸混合均勻，吸50L至第2孔，依此倍比稀釋至第10孔，吸棄50L，稀釋度分別為：1:２、1:4、1:8……4.自第1孔至12孔各加505.自第l孔至12孔各加0.5%雞紅細胞懸液50表4-2病毒血凝克制實驗的操作辦法（單位：L）孔號123456789101112血清稀釋度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:1024病毒對照血清對照生理鹽水5050505050505050505050被檢雞血清50505050505050505050504單位病毒505050505050505050505050室溫中靜置10min505050505050505050505050棄去50成果觀察------++++++++++++++-6.成果鑒定：待病毒對照孔（第11孔）出現(xiàn)紅細胞100%凝集（++++），而血清對照孔（第12孔）為完全不凝集（-）時，即可進行成果觀察。以100％克制凝集（完全不凝集）的被檢血清最大稀釋度為該血清的血凝克制效價，即HI效價。凡被已知新城疫陽性血清克制血凝者，該病毒為新城疫病毒。從表4-2看出，該血清的HI效價為1:64，用以2為底的負對數(shù)(-log2)表達，即6log2。附錄1.阿氏液（Alsever）：即紅細胞保養(yǎng)液枸櫞酸鈉（5H2O）0.80g枸櫞酸（H2O）0.055g葡萄糖2.05g氯化鈉0.42g雙蒸水加至100ml將以上試劑加熱溶解于雙蒸水中，調(diào)節(jié)pH至6.8，115℃滅菌10min,42.0.5%雞紅細胞制備辦法先用滅菌注射器吸取3.8%枸櫞酸鈉溶液(其量為所需血量的1／5)，從雞