肝素酶發(fā)酵車間工藝設(shè)計(jì)方案

年產(chǎn)110噸肝素酶發(fā)酵車間工藝設(shè)計(jì)摘要肝素酶指一類能夠特異性裂解肝素和類肝素主鏈糖苷鍵的酶，被用于去除血液中的肝素，測定肝素的構(gòu)造，以及抗腫瘤等醫(yī)學(xué)方面的研究。國外對(duì)肝素酶的研究已有40數(shù)年歷史，涵蓋菌種篩選、發(fā)酵產(chǎn)酶、分離純化、克隆體現(xiàn)等領(lǐng)域。我國起步很晚，現(xiàn)在僅見中科院（北京）微生物研究所和四川大學(xué)有有關(guān)肝素酶研究的報(bào)道。 現(xiàn)在世界上研究最多、最進(jìn)一步的肝素酶仍然由肝素黃桿菌發(fā)酵生產(chǎn)而來。本文通過肝素酶發(fā)酵工藝的研究，涉及滅菌工藝研究、提取工藝的研究、濃縮和干燥工藝研究及成型工藝研究，將其研制成工藝切實(shí)可行、質(zhì)量穩(wěn)定可控的酶制劑。并對(duì)肝素酶制劑車間生產(chǎn)工藝進(jìn)行研究，對(duì)工藝流程、物料衡算、熱量衡算、車間布置、管道布置、三廢解決、設(shè)備造型等核心工藝進(jìn)行設(shè)計(jì)，為肝素酶車間工藝的設(shè)計(jì)提供根據(jù)。b5E2RGbCAP核心詞：肝素酶；車間布置；工藝流程圖AbstractInthesepiecesisinundertheguidanceofTCMtheory,combinedwithclinicaldoctorstheapplicationandselectedclinicalexperienceformanyyears,hasqingrejiedu,spleenandstomach,invigoratethecirculationofbulge,clinicallyusedforchronicgastritis,gastriculcer,accompaniedbyintestinalmetaplasiaatypicalsymptoms.Hisownbythese,spreadinghedyotisherb,rhizomacoptidis,etcoftenherbs,ofwhichoneoftheseforhisowngentlemanmedicine,therefore,intheseextractiontechnologyonthebasisoftheexperimentalresearch,theapplicationformofhisownfromthetraditionalone,developedintotakingconvenientoralsolidpreparation,changeonecarryinconvenience,shortcomingsandsoonperishable.Inthisarticle,throughthesepiecesofresearchofpreparationprocess,includingcrushingandsterilizationtechnologyresearch,theextractionprocessofstudy,concentrationanddryingprocessandmoldingprocessresearch,todevelopitintopracticaltechnology,stablequalitycontroloftraditionalChinesemedicinecompoundpreparations.Andinthesepiecestabletworkshopproductionprocess,theprocessflow,materialbalance,heatbalance,workshoplayout,pipinglayout,"threewastes"treatment,equipmentdesignonthekeytechnologysuchasmodelling,providethebasisforthesepiecesworkshopprocessdesipg1nE.anqFDPwKeywords：Heparinase.Plantlayout;ProcessflowdiagramDXDiTa9E3d目錄摘要 1..R.TCrpUDGiTAbstract 2..5.PCzVD7HxA1緒論 j.LB6HrnAILg1.1概述 xH6AQX74J0X肝素酶介紹 6..LDAYtRyKfE1.1.2肝素酶的分類及構(gòu)造 Z6zz6ZB2Ltk肝素酶的穩(wěn)定性 8..dvzfvkwMI1課題研究的目的意義 r9qyn14ZNXI1.3課題研究內(nèi)容、設(shè)計(jì)辦法 1.0EmxvxOtOco1.4設(shè)計(jì)根據(jù)及原則 1..0SixE2yXPq52工藝流程概述 1..1.6ewMyirQFL2.1文獻(xiàn)報(bào)道的合成工藝簡述 1.1kavU42VRUs各步生產(chǎn)流程 1..2y6v3ALoS892.4工藝流程框圖 1..3M2ub6vSTnP2.5工藝條件及生產(chǎn)安排 1..60YujCfmUCw3物料衡算 1..7.eUts8ZQVRd3.1衡算基準(zhǔn)和設(shè)計(jì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù) 1s7QsAEJkW5T年產(chǎn)110噸肝素酶發(fā)酵車間物料衡算 1.7GMsIasNXkA4熱量衡算 1TI8rRGchYzg熱量衡算的意義 1..87EqZcWLZNX對(duì)于每一種單元操作進(jìn)行能量衡算 1.8lzq7IGf02E5設(shè)備選型 1zv9pgeqJ1hk發(fā)酵罐 2N0rpoJac3v15.2電熱蒸發(fā)發(fā)生器 2..21nowfTG4KI5.3種子罐的設(shè)計(jì)與選型 2..2fjnFLDa5Zo6管道選型設(shè)計(jì) 2..3.tfnNhnE6e56.1概述 2Hb3mVN777sL管道設(shè)計(jì)原則 2V37l4jRB8Hs車間管道設(shè)計(jì)規(guī)定 2..383lcPA59W97車間布置 m2Z4kklkzaaP7.1車間設(shè)計(jì)的基本原則 2..4AVktR43bpw車間布置設(shè)計(jì)的目的和重要性 24ORjBnOwcEd車間布置的有關(guān)技術(shù)規(guī)定和參數(shù) 242MiJTy0dTT設(shè)備的安全距離 2..5gIiSpiue7A設(shè)備布置原則 2..6uEh0U1Yfmh7.2車間平面布置 2..7IAg9qLsgBX車間布置平面圖 2..7WwghWvVhPE車間產(chǎn)塵的解決 2..7asfpsfpi4k車間排熱、排濕及臭味的解決 2o8oeyYZTjj1參觀走廊的設(shè)立 2.8BkeGuInkxI安全門的設(shè)立 2..8PgdO0sRlMo設(shè)備的安裝 2..83cdXwckm158“三廢”解決及其回收運(yùn)用 2..9h8c52WOngM廢氣的解決 2.9.v4bdyGious廢液的解決 2..9J0bm4qMpJ98.3廢料銷毀 2X9VauA9grYP9結(jié)論及建議 3..0.bR9C6TJscw9.1結(jié)論 3pN09LBDdtrd9.2建議 3D0J8T7nHuGT參考文獻(xiàn) Q3F281D7bvUA附錄一 43B47a9QFw9h附錄二 i3x67iFA8xoX附錄三 w3t86qbkCyDE致謝 K4p15zH46zRk1緒論1.1概述1.1.1肝素酶介紹肝素酶是一類能降解肝素類物質(zhì)的裂解酶。在真核生物中，肝素酶通過水解硫酸乙酸肝素蛋白聚糖(HSPGs)的肝素類側(cè)鏈破壞細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜(BM)的基本構(gòu)造，釋放并激活連接在肝素類側(cè)鏈上的活性物質(zhì)，與血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、炎癥等病理過程親密有關(guān) w。原核生物肝素酶現(xiàn)在重要來源于肝素黃桿菌 (Flavobacteriumheparinum)，在制備低分子肝素(LMWHs)、消除體外循環(huán)中的肝素抗凝劑、擬定肝素精確構(gòu)造等方面有著重要的用途。但是，肝素酶穩(wěn)定性差、不易提純，因而價(jià)格昂貴，限制了其在醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。因此，研究和理解肝素酶的構(gòu)造、性質(zhì)和生物學(xué)特性，對(duì)優(yōu)化肝素酶的工業(yè)生產(chǎn)，拓寬肝素酶的應(yīng)用領(lǐng)域有著重要的意義。Yl4HdOAA611.1.2肝素酶的分類及構(gòu)造分類肝素酶最初是從肝素黃桿菌(Flavobacteriumheparinum)中被發(fā)現(xiàn)和分離的。肝素黃桿菌為一類來自土壤的革蘭陰性菌，現(xiàn)在已經(jīng)從中分離純化得到 3種肝素酶:肝素酶I(HeparinaseI}EC4.2.2.7)肝素酶II(HeparinaseII，無酶編號(hào))和肝素酶III(HeparinaseIII.EC4.2.2.8)03種肝素酶的重要區(qū)別在于相對(duì)分子質(zhì)量(}>、電荷性質(zhì)及底物特異性的不同。肝素酶I，hfr43.8kD，等電點(diǎn)9.3,能夠特異性的切割肝素類分子中6SG1cNS(1-}4)2SldoA之間的連接鍵；肝素酶III}M}73kD，等電點(diǎn)約為10，能夠特異性的切割硫酸乙酞肝素類分子中G1cNS/G1cNAc(1-4)G1cA之間連接鍵。肝素酶II是3種肝素酶中分子量最大(84.5kD)和底物選擇性最寬的一種，等電點(diǎn)約為8.9，對(duì)肝素類和硫酸乙酞肝素類連接位點(diǎn)都有切割作用。ch4PJx4BlI序列通過DNA序列分析表明，3種肝素酶是完全不同的基因產(chǎn)物。肝素酶I,II和III的基因分別含有1152bp}2316by和1977by的開放讀碼框架，編碼含有384,772和659個(gè)氨基酸序列的蛋白前體，前體表達(dá)后在氨基膚酶的作用下發(fā)生Edman降解，從A1a21-G1n22,Ser25-G1n26和A1a24-G1n25處分別切去21,25和24個(gè)氨基端前導(dǎo)膚序列，形成成熟的肝素酶I、II和III。qd3YfhxCzo糖基化1.2.2糖基化原核生物的本身蛋白發(fā)生糖基化的現(xiàn)象是比較少見的，但由肝素黃桿菌分離得到的5種多糖裂解酶(另外兩種是軟骨素酶AC和軟骨素酶B)中只有肝素酶III不存在糖基化位點(diǎn)。肝素酶I糖基化位點(diǎn)在Ser39,連接一種分子量約1.1kDa的糖鏈hl，序列為Gal-S(1-4)[Gal-a(1-3)](2-0-Me)Fuc-}(1-4)Xyl-S(1-4)G1cUA-a(1-2)[Rha-a(1-4)]Man-a(1-0)Ser,肝素酶II糖基化發(fā)生在Thr134,連接一種序列為Man-(Rha)-G1cUA-Xyl的四糖。E836L11DO5催化區(qū)域酶與底物的作用機(jī)制與酶的構(gòu)造特別是高級(jí)構(gòu)造親密有關(guān)，現(xiàn)在有關(guān)3種肝素酶的二級(jí)和高級(jí)構(gòu)造還不清晰。Sasisekharan實(shí)驗(yàn)室對(duì)其活性中心及底物結(jié)合位點(diǎn)作了大量的研究，并對(duì)其催化區(qū)域進(jìn)行了考察，找到了某些維持酶催化活性所必需的氨基酸。肝素酶I中處在高度陽電荷環(huán)境中的Cy:;135為其活性位點(diǎn)，附近含有兩個(gè)陽電荷簇(Phe197}Asp204和G1u207'Asp212)含有Cardin-Weintraub肝素結(jié)合共有序列，陽電荷簇中的His203對(duì)于肝素酶I的催化活性起到核心作用，而 Lys199可能通過穩(wěn)定底物肝素糖醛酸C-6位的陰離子而直接參與催化反映，同時(shí)能夠穩(wěn)定Cys135的疏基而起到協(xié)同催化作用.，因此能夠推測Cys135,His203和Lys199共同構(gòu)成了肝素酶I的催化區(qū)域，而陽電荷殘基Lys198和Lys132對(duì)維持催化必需的微環(huán)境起到了重要作用。另有研究表明，肝素酶I的活性中心需要一種強(qiáng)的還l系環(huán)境，因此加入抗氧化劑(如DTT)有助于提高肝素酶I的活性。肝素酶II中Tyr257,His238,His451和Ilis579殘基對(duì)酶的催化活性至關(guān)重要，但具體催化機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明‘}l。在肝素酶III中，His295和His510是維持活性的必需氨基酸。S42ehLvE3M鈣結(jié)合位點(diǎn)在肝素酶I和III中，鈣離子對(duì)維持酶的活性起到了重要的作用.肝素酶I中存在兩個(gè)鈣結(jié)合基序CB-1和CB-2(Glu207"Val219;Val373"Ala384)，定向突變顯示CB-1,CB-2通過不同的作用機(jī)制在維持肝素酶I的活性方面都發(fā)揮了重要作用。CB-1重要通過影響酶與鈣的結(jié)合而影響酶的活性，相對(duì)于影響鈣的結(jié)合CB-2更多地通過其它復(fù)雜機(jī)制影響酶的活性。在肝素酶III中也同樣存在兩個(gè)鈣結(jié)合基序（Leu390"G1y405;Arg576"Asn591），鈣離子可能是通過與底物的特異性區(qū)域結(jié)合而變化其構(gòu)象使其更適合與酶結(jié)合， 或者鈣、底物和酶結(jié)合成一種三元絡(luò)合物而發(fā)揮作用.但在肝素酶II中不存在任何的鈣結(jié)合共有序列，因此鈣離子對(duì)肝素酶n來說不僅不能激活反而克制酶的活性。501nNvZFis（5）蛋白構(gòu)造根據(jù)3種肝素酶的序列，肝素酶I被列入多糖裂解酶家族PL13,肝素酶m被列入PL12,而肝素酶II由于其獨(dú)特的基本序列還缺少有效的構(gòu)造數(shù)據(jù)將其分類 .Shaya等L47通過分析肝素酶II的晶體構(gòu)造證明，肝素酶II蛋白有三個(gè)區(qū)域構(gòu)成：茫末端區(qū)（Gin26}Arg356;14個(gè)。螺旋）,中央?yún)^(qū)（Asp357}Asn676;16個(gè)p折疊）和C-末端區(qū)（Thr677}Arg772;9個(gè)p折疊），類似于PL8家族軟骨素裂解酶AC和透明質(zhì)酸裂解酶，不同的是肝素酶II以穩(wěn)定的非對(duì)稱的同二聚體形式存在，兩個(gè)活性位點(diǎn)各自分居在兩個(gè)單體上， 其中央?yún)^(qū)存在一種Zn2+離子，對(duì)維持兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起重要作用.現(xiàn)在有關(guān)肝素酶I和III的立體構(gòu)造尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。jW1viftGw9肝素酶的穩(wěn)定性肝素酶的穩(wěn)定性較差，這一缺點(diǎn)是造成現(xiàn)在尚沒有好的方法來獲得活性和產(chǎn)量均較好的肝素酶的重要因素。肝素酶I以液體形式寄存在4'C環(huán)境下，在很短的時(shí)間內(nèi)活性即減少為原來的50%，而通過一次凍融、一次凍干其活性只能保持為原來的 45%和25%}ZJ.普通狀況下，得到純化的肝素酶需要4~5步的操作，而在這個(gè)過程中用現(xiàn)在的制備辦法酶的活性損失巨大，產(chǎn)率很難超出10%oMa等通過在發(fā)酵中添加氯化鈣的辦法將活性酶的產(chǎn)率提高到 17.8%，并且發(fā)現(xiàn)氛化鈣能夠作為肝素酶I的穩(wěn)定劑，在4'C環(huán)境下向酶液中添加1mmol?L-'氯化鈣2天后活性保持了80%，5天后仍能保持到55%;隨著氛化鈣加入量的增大酶穩(wěn)定性進(jìn)一步提高，加入100mmo1"L'氯化鈣2天內(nèi)未見酶活性減少.但在凍融條件下，需要較高的濃度才干達(dá)成穩(wěn)定的效果.鈔亞鵬等嘗試了用固定化的辦法來增加肝素酶的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)表明將肝素酶固定于聚酷載體上，基本上保持了游離酶的理化性質(zhì)和催化特性，酶的使用半衰期延長了4.4倍.有報(bào)道指出向肝素酶中添加牛血清蛋白（BSA）和乳糖也能夠增加酶的穩(wěn)定性。XS0DOYWHLP肝素酶的應(yīng)用（1）生產(chǎn)低分子肝素低分子肝素是從普通肝素中分離得到低分子量組分，或裂解肝素產(chǎn)生的片段，是新一代肝素類抗血栓藥品，較肝素來說其含有生物運(yùn)用度高、體內(nèi)半衰期長、出血傾向小、口服易吸取等特點(diǎn)。現(xiàn)在工業(yè)生.產(chǎn)低分子肝素的辦法重要是化學(xué)降解和酶降解法，即使化學(xué)降解法工藝流程較簡樸，但裂解過程中加入.的強(qiáng)氧化劑等會(huì)與肝素中的硫酸基團(tuán)作用而引發(fā)肝素抗凝活性的減少，也破壞肝素的構(gòu)造，而肝素酶降解法由于其溫和的反映條件、不引發(fā)肝素構(gòu)造的破壞、無毒性、易實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)持續(xù)化而越來越得到人們的關(guān)注。LOZMkIqI0w（2）體外循環(huán)中消除肝素體外循環(huán)是治療許多心臟疾病的外科技術(shù)手段，為了避免插入心臟或血管的人工管道引發(fā)血凝和形成血栓造成器官栓塞，經(jīng)常在手術(shù)中用肝素調(diào)節(jié)血液的凝固功效。體外循環(huán)結(jié)束后，需要用魚精蛋白來中和加入的肝素，但魚精蛋白引發(fā)的毒性反映涉及低血壓、過敏反映、肺水腫、血小板凝集等日益引發(fā)醫(yī)學(xué)工作者的重視，而肝素酶I能夠在10min內(nèi)中和肝素，因此能夠考慮用肝素酶I替代魚精蛋白作為肝素的中和劑。但Stafford-Smith等研究表明，肝素酶I逆轉(zhuǎn)冠脈搭橋術(shù)后肝素的抗凝作用并不優(yōu)于魚精蛋白，有關(guān)應(yīng)用需要進(jìn)一步的進(jìn)一步研究。ZKZUQsUJed（3）研究肝素的精確構(gòu)造和低聚寡糖活性篩選肝素的構(gòu)造非常復(fù)雜，現(xiàn)在對(duì)其具體構(gòu)造研究仍不透徹。通過控制不同的肝素酶解條件，將肝素降解成大小不等的寡糖片斷，通過分析寡糖片段，進(jìn)一步揭示肝素的精確構(gòu)造。同時(shí)可以研究不同大小塞糖的構(gòu)效關(guān)系，進(jìn)一步篩選含有生物活性的化合物。dGY2mcoKtT（4）藥用研究由于肝素酶的多糖裂解特性，其在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域也有著重要意義。Daud等的研究指出，肝素酶I能夠有效地將戊多糖分解成雙糖和三糖片斷，因此能夠作為戊多糖過劑量時(shí)的中和劑來使用。肝素酶III能夠從細(xì)胞表面及細(xì)胞外基質(zhì)中選擇性的切割硫酸乙酞蛋白聚糖HSPGs}HSPGs作為P-和L-選擇素以及促炎癥介質(zhì)如IL-8的結(jié)合位點(diǎn)，從而肝素酶III能夠可逆性地消除這些結(jié)合位點(diǎn)和炎癥介質(zhì)，通過減少白細(xì)胞波動(dòng)、貓附、外滲來減輕局部缺血再灌注中對(duì)組織的損傷。rCYbSWRLIA1.2課題研究的目的意義酶制劑是一種生態(tài)型高效催化劑，含有高效、安全、節(jié)能、生態(tài)和環(huán)保等特點(diǎn)，能夠有效帶動(dòng)有關(guān)領(lǐng)域技術(shù)水平的提高，對(duì)應(yīng)用產(chǎn)業(yè)開發(fā)新產(chǎn)品，提高質(zhì)量、節(jié)能降耗、保護(hù)環(huán)境含有重要意義，產(chǎn)生了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。酶制劑產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為生物技術(shù)領(lǐng)域的前衛(wèi)產(chǎn)業(yè)和21世紀(jì)最有但愿的新興產(chǎn)業(yè)之一。國家十一五期間已將酶制劑列為重點(diǎn)發(fā)展的領(lǐng)域，將投資幾十億到該產(chǎn)業(yè)，建立生產(chǎn)、研發(fā)、出口、檢測、菌種保藏基地，使中國成為世界酶制劑生產(chǎn)基地和研發(fā)基地，