EMS誘變技術(shù)及其在創(chuàng)造玉米新種質(zhì)中的應(yīng)用精

1、農(nóng)作物化學(xué)誘變育種是人為地利用化學(xué)誘變劑，誘發(fā)作物發(fā)生突變，再通過(guò)多世 代對(duì)突變體進(jìn)行選擇和鑒定，直接或間接地培育成生產(chǎn)上能利用的作物新品種?；瘜W(xué)誘變具有成本低廉、使用方便、誘變作用專一等特點(diǎn)，是一種迅速發(fā)展的農(nóng)作物育種手段。目前，在眾多的化學(xué)誘變劑中，甲基磺酸乙酯（EMS被認(rèn)為是應(yīng)用最好的誘變劑16。EM S誘變技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已成為一種成熟的技術(shù)，在玉米誘變育種中得到廣泛的應(yīng)用。1EMS誘變技術(shù)EMS，即甲基磺酸乙酯，是一種烷化劑，烷化劑EM S所誘發(fā)的突變主要通過(guò)以下 步驟來(lái)完成。烷基化位點(diǎn)主要在 G （鳥嘌呤的N-7位上6,由于G上N-7的烷基化,使之成為帶一個(gè)正電荷的季銨基團(tuán)。這個(gè)季銨基

2、團(tuán)產(chǎn)生兩個(gè)效應(yīng)：一是促進(jìn)第一位氨基上氫解離，使G不再與C配對(duì)而與T配對(duì),從而造成G:C-A:T轉(zhuǎn)換（圖1。二是N-7成為季銨基團(tuán)后，減弱了 N-9位上的N-糖苷鍵，而產(chǎn)生了去嘌呤作用。大部分的無(wú)嘌呤位點(diǎn)都可以被無(wú)嘌呤內(nèi)切酶系統(tǒng)所修復(fù)，但是有時(shí)復(fù)制在修復(fù)之前進(jìn)行，則在無(wú) 堿基位置上可以通過(guò)插入任何一個(gè)堿基，在第二輪復(fù)制以后，則原來(lái)的G : C對(duì)可以 變?yōu)槿魏螇A基對(duì)G : C、C : G、A : T、T : A ,既有轉(zhuǎn)換，又有顛換（圖2。此外,它也可與核苷結(jié)構(gòu)的磷酸反應(yīng)，形成酯類而將核苷酸從磷酸與糖分子之間切斷，產(chǎn)生 染色體的缺失6（圖3。EMS誘變技術(shù)及其在創(chuàng)造玉米新種質(zhì)中的應(yīng)用安偉,樊智翔，

3、馬海林,米小紅,王計(jì)虎（山西農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州034000摘要:綜述了 EMS的作用機(jī)制、作用特點(diǎn)及EMS在創(chuàng)造玉米新種質(zhì)中的應(yīng)用等方面的內(nèi)容，并對(duì)EM S在玉米遺傳育種研究中的利用前景進(jìn)行了論述。關(guān)鍵詞:EM S ;誘變技術(shù);玉米;新種質(zhì)中圖分類號(hào)：S513.032文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào)：1002-2481(200812-0037-03In duced Mutati on Tech nique and App licati on of EMS toCreate New Corn Germpl asmAN Wei ,FAN Zhi-xia ng ,MA Hai-li n ,MI X

4、iao-ho ng ,WANG Ji-hu(Maize Research In stitute ,Sha nxi Academy of Agricultural Scie nces ,Xin zhouSha nxi ,034000,Ch inaAbstract:The mechanism、property and application of EMS for creation of new corn ger mp lasm etc.was reviewed in the pap er.The prospect of EMS utilizati on in research of corn ge

5、n etic and breed ing was also poin ted out.Key words:EMS ;ln duced Mutatio n Tech nique ;Cor n ;New ger mp lasm*收稿日期:2008-11-13作者簡(jiǎn)介:安偉(1975-,男，山西代縣人，助研，主要從事玉米遺傳育種工作。Journal of Shanxi Agricultural Scien ces山西農(nóng)業(yè)科學(xué)2008,36(12:3739圖1N-7烷基化鳥嘌呤由于N-1位上H的電離而與胸腺嘧啶配對(duì)，從而導(dǎo)致G:C-A:T轉(zhuǎn)換圖2N-7烷基化鳥嘌呤通過(guò)去嘌呤作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)換和顛換37圖3烷

6、化劑誘導(dǎo)染色體缺失模式Hake等人采用分子遺傳學(xué)手段,驗(yàn)證了 EM S誘導(dǎo)的8個(gè)穩(wěn)定玉米乙醇脫氫酶 adh突變體均為點(diǎn)突變9。 Burns等報(bào)道在EM S誘導(dǎo)的184個(gè)大腸桿菌突變都是 單個(gè)堿基對(duì)改變，其中183個(gè)G : C變?yōu)锳 : T7。 Lebkowski研究表明EM S誘導(dǎo)的人類54個(gè)突變中有53個(gè)也是由G : C變?yōu)锳 : T8。這表明EMS誘導(dǎo)的突變主 要是點(diǎn)突變。2EMS誘變的特點(diǎn)2.1誘變效率高EMS化學(xué)誘變產(chǎn)生的點(diǎn)突變的頻率相對(duì)較高，而染色體畸變相對(duì)較少，生理?yè)p傷小。因而可被用來(lái)對(duì)玉米的某一特殊性狀進(jìn)行改良，并且容易出現(xiàn)高產(chǎn)、質(zhì)優(yōu)的突 變體3。若引起染色體的損傷，主要是染色單

7、體斷裂，且斷裂后不再連接起來(lái)6 02.2誘變頻率高Bird報(bào)道用EMS處理玉米花粉，突變頻率可高達(dá)78%。并且與其它誘變劑相 比,EMS誘變后產(chǎn)生的顯性突變體相對(duì)較多1，因而易于進(jìn)行突變體篩選。2.3誘變范圍廣誘變范圍廣，出現(xiàn)的突變體類型較多。雖然烷化作用主要引進(jìn)的是 G : C、A : T堿基對(duì)之間的轉(zhuǎn)換，但是同時(shí)也可出現(xiàn)其它各種類型的突變體，因而具有多效性。3EMS在創(chuàng)造玉米新種質(zhì)中的應(yīng)用在眾多的化學(xué)誘變劑中，EMS作為作物最有效的化學(xué)誘變劑之一，早在60年代EM S就被用于玉米誘變育種10。當(dāng)時(shí)是用EMS水溶液處理玉米種子,Cornu,et al. 用EMS處理感染小斑病的法國(guó)自交系種子

8、，而后把M代正在發(fā)芽的種子放在小斑病菌液上生長(zhǎng)，或用小斑病菌液噴灑幼苗，兩個(gè)處理 均篩選出了抗性個(gè)體1。一般來(lái)說(shuō),EMS水溶液處理玉米種子效果較差。這是因 為:(1EMS與水起作用產(chǎn)生不起誘變作用但有毒的化合物：甲磺酸和乙醇(CHSO2OC2H5+H2O-CH3SO2OH+C2H5OH,甲磺酸顯著的引起植物損傷和不育；(2胚細(xì)胞在成熟的種子中被許多有生命的細(xì)胞包圍，再加上細(xì)胞膜的雙透性就阻礙了 EMS進(jìn)入胚細(xì)胞;(3產(chǎn)生的突變基因難固定致終，種子的胚細(xì)胞在分化出配子體以后，要經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次 的細(xì)胞分裂和分化，一些突變因子在染色體無(wú)數(shù)次的復(fù)制過(guò)程中不易表達(dá)而丟失11。此外，種子處理易產(chǎn)生嵌合體，要篩

9、選的誘變后代群體大，顯性突變?cè)贛代表現(xiàn)，隱性突變?cè)贛代才能表現(xiàn)出來(lái)，得到穩(wěn)定突變體所需的時(shí)間長(zhǎng)。Coe于1966年發(fā)現(xiàn)玉米花粉可以在石蠟油中懸浮幾個(gè)小時(shí)仍保持生命力，把它們涂到花絲上，仍能正常授精結(jié)實(shí)。后來(lái) Neuffer將此發(fā)現(xiàn)加以引伸，進(jìn)一步把化學(xué) 誘變劑懸浮于石蠟油中，而后與玉米花粉混合進(jìn)行誘變，獲得成功。經(jīng)過(guò)以后不斷改進(jìn)和完善，現(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)成為玉米誘變育種的主要手段。1986年，美國(guó)ICI種子公司Greaves等用EM S的石蠟油溶液處理玉米自交系的成熟花粉40min,在M2代用除草劑進(jìn)行篩選，獲得9株抗除草劑普殺特（Pursuit突變體，其中反應(yīng)最佳的植株可 以忍受10倍除草劑致

10、死劑量。該基因?yàn)榭钩輨╋@性基因，命名為IT（lmazethapyrTolerant,并申請(qǐng)專利保護(hù)。1991年ICI公司首次推出含IT抗除草劑基因的玉米雜 交種。因它不屬于轉(zhuǎn)基因玉米，不存在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問(wèn)題，所以市場(chǎng)反應(yīng)良 好。當(dāng)年該種子銷售額達(dá)250萬(wàn)美元,1992年突破1000萬(wàn)美元。1987年該公司用 此方法獲得糯質(zhì)突變3個(gè)、甜質(zhì)突變3個(gè)，突變率均為0.12%5。1991年張銘堂利 用EM S處理玉米花粉，發(fā)現(xiàn)糯質(zhì)基因WX的誘變頻率為0.12%。1992年AllenWright（依阿華大學(xué)用EM S處理B73的花粉從M3后代中選出10個(gè)高賴氨酸、8 個(gè)高蛋白、7個(gè)高油、4個(gè)高亞油

11、酸、3個(gè)高油酸和9個(gè)低棕櫚酸材料。VictorRoboy（蒙坦拿大學(xué)從EM S花粉誘變后代中選出兩個(gè)高油突變體5。Neuffer采用 該方法獲得大量突變體，僅經(jīng)過(guò)仔細(xì)研究并進(jìn)行基因定位的就有 760個(gè)。這些表明EMS花粉化學(xué)誘變技術(shù)已獲得成功，并且已在國(guó)外得到應(yīng)用。國(guó)內(nèi)一些育種單位目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到 EMS花粉誘變技術(shù)的重要性，相繼開展了這方面的工作。郭麗娟等人（1987用EM S處理玉米八趟白單倍體胚性細(xì)胞無(wú)性系 以玉米小斑病菌毒素為選擇劑獲得了抗玉米小斑病突變體。劉治先 （1998用EMS 花粉誘變技術(shù)篩選出兩類高油酸玉米突變體，10個(gè)高賴氨酸、8個(gè)高蛋白、7個(gè)高 油、4個(gè)高亞油酸突變體，為特

12、用玉米育種和遺傳研究提供了可貴的材料。趙永亮（1998對(duì)花粉誘變快速創(chuàng)造特用玉米新種質(zhì)這一現(xiàn)山西農(nóng)業(yè)科學(xué)2008年第36卷第12期38代生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，化學(xué)誘變?cè)趦蓚€(gè)世代就可創(chuàng)造迄今為止 所積累的所有特用玉米類型，包括白玉米、甜玉米、糯玉米、超甜玉米和高直鏈淀 粉玉米。薛守旺（1998采用同樣方法處理了 6個(gè)穩(wěn)定玉米自交系的成熟花粉，結(jié)果得到淺黃粒突變體、母株穗發(fā)芽突變體、顯性核不育突變體和sulsul甜玉米。EMS化學(xué)誘變可誘發(fā)每一個(gè)基因位點(diǎn)發(fā)生突變，這樣不僅可創(chuàng)造出在育種中有 用的新的突變種質(zhì)資源，而且有可能產(chǎn)生生物學(xué)上有用的突變體，它們雖然不能產(chǎn)生 直接的經(jīng)濟(jì)效益，但是可

13、以利用它們對(duì)生物進(jìn)化過(guò)程中曾經(jīng)出現(xiàn)過(guò)的遺傳變異進(jìn)行全面檢索和研究，為玉米生長(zhǎng)發(fā)育等基礎(chǔ)性研究提供一些合適的素材。Hoisingto和Neuffer在EM S玉米花粉處理后代中都發(fā)現(xiàn)了病斑突變體，這類突變體在不受病原 菌侵染的條件下出現(xiàn)病斑，它們似乎是將控制抗體產(chǎn)生的遺傳機(jī)制打開，導(dǎo)致基因開 始起作用。通過(guò)研究，使人們對(duì)病癥表達(dá)過(guò)程中寄主作物所起的作用有新的認(rèn)識(shí)。1988年,Shozo Fujioka利用5種單基因矮化玉米突變體，研究了赤霉素的合成途徑，為 后人認(rèn)識(shí)激素的作用機(jī)理，尤其是從分子角度來(lái)理解激素的反應(yīng)途徑提供了重要依 據(jù)。M iles等人通過(guò)對(duì)EM S誘導(dǎo)的hcf突變體的研究，從而使

14、人們加深了對(duì)光反應(yīng)過(guò)程中電子傳遞的遺傳控制的理解。此外，EM S誘導(dǎo)的突變體在淀粉和蛋白質(zhì)合成、光合作用過(guò)程、植物發(fā)育過(guò)程的研究過(guò)程中，都起了很大的作用。4EMS的應(yīng)用前景4.1對(duì)誘變后代進(jìn)行分子生物學(xué)研究近年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)研究的深入，為EM S在作物遺傳育種上的應(yīng)用研究開辟了一條新的途徑。運(yùn)用DNA分子標(biāo)記對(duì)EMS誘變后代進(jìn)行分析，不但能鑒定出 肉眼鑒別或儀器分析無(wú)法鑒別的突變，而且使對(duì)突變性狀的遺傳研究和定位變得更 加方便和有效，同時(shí)可據(jù)此繪制相應(yīng)的基因圖譜，并在分子水平上對(duì)突變熱點(diǎn)與突變 機(jī)理進(jìn)行分析。目前，這方面的研究報(bào)道還很少。因此，在我國(guó)開展DNA分子標(biāo)記 技術(shù)與誘變技術(shù)相結(jié)合

15、的研究，將具有重大的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。4.2對(duì)誘變后代進(jìn)行抗除草劑的篩選由于突變幾乎影響到玉米形態(tài)的每一個(gè)方面所以采用化學(xué)誘變可以誘發(fā)各種突變。雖然化學(xué)誘變是不定向的，但是只要對(duì)誘變后代群體加以適當(dāng)?shù)倪x擇條件，就可能獲得所需 的有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的新突變。隨著分子生物學(xué)研究的發(fā)展，抗除草劑作物已引起人們的廣泛關(guān)注。當(dāng)前，玉米上應(yīng)用的除草劑如阿特拉津、乙阿合劑等均為選擇性除草劑，它們的除草譜較窄，對(duì)有些雜草殺滅效果差；對(duì)噴藥時(shí)期要求嚴(yán)格，一旦錯(cuò)過(guò)噴藥的適宜時(shí)期則除草效果銳 減;藥劑施用成本高。在21世紀(jì)，高效、滅生性除草劑的開發(fā)將成為除草劑開發(fā)的主 流,特別是幾十年來(lái)長(zhǎng)盛不衰的有機(jī)磷除草劑草甘磷將得到

16、廣泛的應(yīng)用。針對(duì)廣譜、滅生性除草劑研制出抗除草劑玉米已 經(jīng)成為國(guó)際玉米雜交種發(fā)展的方向，在美國(guó)玉米市場(chǎng)上有近半數(shù)是抗除草劑品種，而 我國(guó)目前還沒有抗除草劑玉米問(wèn)世，也未見國(guó)內(nèi)有這方面的研究報(bào)道。借鑒國(guó)外的經(jīng)驗(yàn)對(duì)EMS處理的M群體進(jìn)行抗除草劑草甘磷篩選，以期篩選出抗除草劑突變體。對(duì)抗性基因進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定后,通過(guò)回交或其他生物技術(shù)轉(zhuǎn)入玉米雜交種，可望創(chuàng)造出具有重大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì) 效益的育種材料和雜交種。參考文獻(xiàn):1Bird,R.M ck.,a nd M.G.Neuffer.l nduced mutatio ns in maize.l nJJa nick(ed. Plant Breedi ng

17、Reviews(5J.New York:Va n Nostra nd Rei nhold, 1987,139-180.2馬惠平，趙永亮,楊光宇.誘變技術(shù)在作物育種中的應(yīng)用J.遺傳,1998,20(6:41-43.3史桂榮.化學(xué)誘變劑在玉米育種上的應(yīng)用J.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),1994,(6:44-46.4朱保葛，路子顯,耿玉軒，等.烷化劑EM S誘發(fā)花生性狀變異的效果及高產(chǎn)突變系的選育J.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997,30(6:87-89.劉治先.玉米育種技術(shù)J.玉米科學(xué),1995,3(4:12-15.張銘堂.誘變J.科學(xué)農(nóng)業(yè),1996,44(1,2:37-52.7 Burns ,P .A.,F L.AI

18、Ie n,a nd B.W.GIickma n.DNA seque nee an alysis ofmutage ni city and site sp ecificity of ethly metha ne sulfo nate in Uvr and UvrB strai ns of E.ColiJ.Ge neties,1986,113:811-819.8 Hake,s.,w.c.Taylor,a nd M.Freeli ng.M olecular an alysis of gen etically stablemuta nts of the maize Adhl gen eJ.M ol.Ge n.Ge net,1984,194:42-48.9 Lebkowski,J.S.J.H.M iller,a nd M.P .Calos.Determi nati on of DNA seque nee cha nges in duced by ethyl metha ne sulfo