真核岡崎片段成熟機(jī)制的研究進(jìn)展

真核岡崎片段成熟機(jī)制的研究進(jìn)展

真核生物的dna復(fù)制從多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)開始。由于dna雙螺旋旋反向結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)以及已知dna聚合酶53的保守方向，原導(dǎo)鏈在復(fù)制板運(yùn)動(dòng)的方向上連續(xù)合成，而后鏈在復(fù)制板的相反方向上不連續(xù)合成（100.150nt）。基于SV40DNA復(fù)制體系研究,目前認(rèn)為岡崎片段的合成有兩種不同聚合酶復(fù)合物參與,分成三個(gè)階段:(1)Polδ-引發(fā)酶首先合成RNA,再將引物延伸產(chǎn)生DNA短序列(iDNA),形成RNA-DNA引物;(2)Polδ-引發(fā)酶和RFC/Polδ/PCNA轉(zhuǎn)換;(3)真核DNA聚合酶δ(Polδ)持續(xù)合成至遇到前一個(gè)岡崎片段5′端。在滯后鏈模板上經(jīng)過不連續(xù)合成產(chǎn)生的短的岡崎片段,必須轉(zhuǎn)變成無間隙DNA產(chǎn)物,這一過程稱為岡崎片段的成熟,包括若干步驟:切除RNA引物、填補(bǔ)間隙、連接兩個(gè)DNA片段等。1.其他蛋白酶引物真核生物DNA聚合酶缺乏內(nèi)在的5′→3′核酸外切酶活性,RNA引物的切除需要其他蛋白酶的參與。早期Waga等證明在滯后鏈成熟過程中,切除岡崎片段5′端RNA引物依賴于核酸酶RNaseHI和FEN1。它們切除RNA引物的具體步驟如下:首先RNaseHI利用核酸內(nèi)切酶活性切割岡崎片段5′端的RNA片段,在RNA-DNA引物連接點(diǎn)旁留下一個(gè)核糖核苷酸;然后FEN1利用5′→3′核酸外切酶活性切除這最后一個(gè)核糖核苷酸。在SV40復(fù)制系統(tǒng)中,RNaseHI和FEN1對(duì)新生岡崎片段的加工成熟必不可少。但在酵母中,RNaseHI和FEN1對(duì)細(xì)胞的生存都不是必需的,RNaseHI基因(rnh35)和FEN1基因(rad27)雙突變的細(xì)胞也能生存,這表明真核岡崎片段的成熟機(jī)制非常復(fù)雜,還存在另一種機(jī)制,通過其他蛋白酶切除岡崎片段5′端的引物。最近有許多新的研究和發(fā)現(xiàn)支持這一觀點(diǎn),這些新發(fā)現(xiàn)主要有:(1)FEN1除具有5′→3′核酸外切酶活性,還具有結(jié)構(gòu)特異性的核酸內(nèi)切酶活性,能特異切割具有5′-flap(蓋子)結(jié)構(gòu)的單鏈DNA底物(圖2c)。FEN1不能與雙鏈DNA蓋子和結(jié)合RPA蛋白的單鏈DNA蓋子結(jié)合,FEN1在單鏈DNA蓋子結(jié)構(gòu)分支點(diǎn)切割;FEN1的最適底物是上游引物3′端有一個(gè)核苷酸尾的雙蓋子結(jié)構(gòu),即一個(gè)岡崎片段3′端和前一個(gè)岡崎片段5′端均有部分核苷酸未形成雙鏈互補(bǔ)結(jié)構(gòu)(圖2d),FEN1的切割位點(diǎn)位于雙鏈互補(bǔ)區(qū)內(nèi)+1個(gè)核苷酸,這有利于產(chǎn)生適于DNA連接酶連接的切口。(2)Dna2具有ATPase、解旋酶和核酸內(nèi)切酶活性,其中核酸內(nèi)切酶活性在岡崎片段的成熟中發(fā)揮重要作用,這一活性不具有結(jié)構(gòu)特異性,容易切割具自由末端的單鏈DNA,并且能被5′端有RNA的單鏈DNA激活。Dna2的解旋酶活性能防止5′端長(zhǎng)蓋子結(jié)構(gòu)形成二級(jí)結(jié)構(gòu),促進(jìn)Dna2有效切割蓋子結(jié)構(gòu),但對(duì)岡崎片段的成熟并非必需。(3)單獨(dú)的Dna2不能有效促進(jìn)切口平移,也不影響FEN1進(jìn)行的切口平移。在DNA連接酶存在時(shí),用各種下游引物研究岡崎片段成熟,下游DNA引物、RNA引物和短5′-蓋子結(jié)構(gòu)都能被FEN1和Polδ有效加工成熟。但是切割結(jié)合RPA的長(zhǎng)蓋子結(jié)構(gòu)(>30nt)要求FEN1必須和Dna2協(xié)同作用。(4)在Polδ存在時(shí),RPA能激活Dna2對(duì)岡崎片段5′端長(zhǎng)蓋子結(jié)構(gòu)(>30nt)的切割活性,并阻止FEN1結(jié)合到長(zhǎng)蓋子結(jié)構(gòu),從而抑制FEN1對(duì)后者的切割。(5)FEN1、Dna2、RPA和Polδ都與PCNA結(jié)合,提示參與岡崎片段成熟的蛋白質(zhì)彼此協(xié)同作用。2003年,Ayyagari等基于上述研究提出岡崎片段成熟的一種新機(jī)制:當(dāng)它到達(dá)前一個(gè)岡崎片段5′端,Polδ繼續(xù)前進(jìn)合成,前一個(gè)岡崎片段5′端撬起形成蓋子結(jié)構(gòu),如果蓋子長(zhǎng)度大于30nt,單鏈DNA足以形成RPA結(jié)合位點(diǎn),RPA結(jié)合到單鏈DNA并開始募集Dna2,后者利用核酸內(nèi)切酶活性切除并生成短蓋子(5～7nt),Dna2從單鏈解離下來,FEN1切除短蓋子結(jié)構(gòu)(圖1左)。如果蓋子長(zhǎng)度小于30nt,單鏈DNA不足以形成RPA結(jié)合位點(diǎn),FEN1利用核酸內(nèi)切酶活性在雙鏈區(qū)第一個(gè)配對(duì)堿基處切割(圖1右),產(chǎn)生具有單一切口的兩個(gè)DNA片段;DNA連接酶連接切口。2.pol-要素及其衍生物DNA聚合酶在DNA復(fù)制、修復(fù)和重組中起重要作用,一些原核和真核的DNA聚合酶具有內(nèi)在的3′→5′核酸外切酶活性。結(jié)構(gòu)研究表明:所有DNA聚合酶的3′→5′核酸外切酶結(jié)構(gòu)域高度保守,由ExoⅠ、ExoⅡ和ExoⅢ三部分組成。外切酶結(jié)構(gòu)域位于N末端,與聚和酶結(jié)構(gòu)域分離,新生鏈3′端從聚合酶活性中心進(jìn)入外切酶部位時(shí),必須降解末端3～4個(gè)配對(duì)堿基。DNA聚合酶內(nèi)在的3′→5′核酸外切酶活性具有校正功能,將剛剛合成的堿基配對(duì)錯(cuò)誤或移碼插入的核苷酸切除,保證DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性。Polδ的聚合酶活性參與岡崎片段的延伸和替代合成。最近Jin等發(fā)現(xiàn)Polδ的3′→5′核酸外切酶活性可以替代Rad27/FEN1的作用(圖2),在岡崎片段成熟中起著不同于校正功能的另一種生物作用,其實(shí)驗(yàn)依據(jù)主要有:(1)在FEN1基因/rad27缺陷的酵母細(xì)胞,Polδ的ExoⅠ/ExoⅡ/ExoⅢ突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡,而其他部位突變無協(xié)同致死性。rad27p(rad27突變基因,其F346A/F347A兩個(gè)氨基酸改變,不能和PCNA相互作用,但不引起表型改變)和Polδ-ExoⅠ/Polδ-ExoⅡ雙突變也具有協(xié)同致死性,而Rad27p/Polδ-ExoⅢ雙突變酵母細(xì)胞在DSB(double-strandbreaks)重組修復(fù)系統(tǒng)功能完善時(shí)能生存,但會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)復(fù)制雙鏈斷裂突變和染色體間和染色體內(nèi)重組增加,點(diǎn)突變并不增加。這提示,Polδ的3′→5′核酸外切酶活性在在岡崎片段成熟中起著不同于校正功能的另一種生物作用。(2)在PCNA存在時(shí),Polδ和Exo-Polδ以相似速度替代合成(displacementsynthesis),但Exo-Polδ能更有效起始替代合成;Polδ能進(jìn)行正常缺口填補(bǔ),而Exo-Polδ在下游引物被替代3～5nt后暫停合成。(3)在FEN1缺乏時(shí),Polδ進(jìn)行岡崎片段缺口填補(bǔ)時(shí)產(chǎn)生能被DNA連接酶連接的切口,Exo-Polδ進(jìn)行岡崎片段缺口填補(bǔ)時(shí)產(chǎn)生的切口不能被DNA連接酶連接,加入FEN1后產(chǎn)生可共價(jià)關(guān)閉的切口。(4)Polδ-ExoⅢ/Rad27p雙突變對(duì)甲基甲磺酸(methylmethanesulfonate,MMS)敏感,而單個(gè)突變對(duì)MMS不敏感。Jin等認(rèn)為,Polδ的3′→5′核酸外切酶活性能替代FEN1,在岡崎片段成熟中通過對(duì)新生鏈3′端降解,阻止過量的DNA鏈替代合成和過量的5′端蓋子結(jié)構(gòu),確保產(chǎn)生能被DNA連接酶連接的具有單一切口的兩個(gè)DNA片段(圖2c→d→e→b)。在岡崎片段成熟間隙填補(bǔ)過程中,Polδ的3′→5′核酸外切酶活性增強(qiáng)復(fù)制的準(zhǔn)確性,減少?gòu)?fù)制突變(DSB)和染色體重組,有利于保持基因組的穩(wěn)定性。在真核岡崎片段成熟中通過兩條途徑產(chǎn)生可連接切口:(1)FEN1利用核酸內(nèi)切酶活性切除前一個(gè)岡崎片段5′端蓋子結(jié)構(gòu),新生鏈3′端替代合成部分重新配對(duì)成互補(bǔ)雙鏈,形成可連接切口;(2)Polδ利用3′→5′核酸外切酶活性降解新生鏈3′端替代合成部分,前一個(gè)岡崎片段5′端蓋子結(jié)構(gòu)重新配對(duì)成互補(bǔ)雙鏈,形成可連接切口。3.胞結(jié)合體的相關(guān)研究真核岡崎片段成熟是一個(gè)的復(fù)雜的過程,由多種蛋白質(zhì)協(xié)同加工完成。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FEN1、Dna2和Polδ都參與真核岡崎片段成熟加工并發(fā)揮了重要作用,了解了細(xì)胞如何確保滯后鏈復(fù)制的忠實(shí)性,減少?gòu)?fù)制雙鏈斷裂突變(DSB)和染色體重組,但是此領(lǐng)域仍有許多問題懸而未決:(1)