中藥多糖提取工藝的研究

中藥多糖提取工藝的研究

結(jié)果表明，植物糖具有明顯的調(diào)節(jié)免疫、抗病和腫瘤作用，一些植物糖同時(shí)具有廣泛的生物活性，如阻力、降血糖和抗炎作用。中藥川芎、赤芍和黃柏均為我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中重要的常用中藥材,在中醫(yī)療效里均有活血化瘀、陣痛、補(bǔ)血補(bǔ)氣之功效,藥理學(xué)研究表明這3味藥還同時(shí)具有抗癌、增強(qiáng)免疫及抗動(dòng)脈硬化等良好的生物活性。目前對(duì)于3種中藥的小分子成分研究較多,對(duì)多糖的提取及活性的研究甚少。這3種中藥經(jīng)常在處方中組合應(yīng)用,其藥效成分包括小分子和多糖可能存在協(xié)同作用。目前中藥多糖很少有復(fù)方應(yīng)用,除因復(fù)方藥效學(xué)研究較為困難外,不能找到一種簡便方法在多糖混合物中對(duì)某種中藥來源的多糖進(jìn)行精確定量也是一個(gè)重要的限制條件。因此本研究對(duì)3種中藥多糖傳統(tǒng)熱水浸提工藝進(jìn)行優(yōu)化研究,探索最佳的提取工藝條件,在此基礎(chǔ)上,研究同種多糖提取工藝即熱水浸提法對(duì)于不同多糖提取中是否會(huì)存在差異性,包括提取工藝參數(shù)和提取率以及多糖含量等指標(biāo);并對(duì)不同提取方法的多糖得率和溶解性進(jìn)行比較,分析3種多糖組合提取的可行性,為復(fù)方多糖的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。1提取前3種中藥干燥后粉碎成干法的研究中藥材川芎、赤芍和黃柏均購于蘭州黃河藥材市場(經(jīng)蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院,楊林副教授鑒定,符合《中國藥典》2010年版規(guī)定),提取前3種中藥干燥后粉碎成干粉。ES-2002H型電子天平(長沙湘平科技發(fā)展有限公司),KQ-5200型超聲波發(fā)生裝置(昆山超聲儀器),ZF-7型三用紫外分析儀(上海金達(dá)生化儀器有限公司)。葡萄糖、苯酚、硫酸、乙醇、石油醚、三氯甲烷等均為分析純試劑。2方法和結(jié)果2.1種中草藥多糖的提取準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的川芎50g于圓底燒瓶中,加入石油醚(沸程60~90℃)250mL回流2h,脫脂后,抽濾、風(fēng)干;加入95%乙醇250mL回流2h,除單糖、低聚糖,抽濾。濾渣再加入一定量的蒸餾水浸泡過夜;然后回流一定時(shí)間,趁熱抽濾,連續(xù)提取2次,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至小體積待用。采用相同工藝提取赤芍和黃柏。3種中藥多糖溶液加入Sevag試劑(三氯甲烷-正丁醇5∶1)除蛋白,在4℃,3000r·min-1離心15min,取上清液。反復(fù)處理,直至無蛋白層出現(xiàn),完全脫去蛋白為止。向上清多糖溶液中加入3倍體積95%乙醇醇沉過夜,離心取沉淀依次用無水乙醇、丙酮和無水乙醚反復(fù)洗滌,經(jīng)真空干燥后得到精制的3種中藥多糖。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線方程采用硫酸-苯酚法進(jìn)行測定,精密稱取無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.05g于100mL量瓶中,加水溶解并稀釋至刻度,搖勻,然后精密量取5mL,置50mL量瓶中,加水稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液(質(zhì)量濃度0.05g·L-1)。精密量取對(duì)照品溶液0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL,分別置于25mL具塞刻度試管中,各加水至2.0mL,在加入6%苯酚溶液1mL,濃硫酸5mL,搖勻,放冷至室溫后,置60℃水浴中保溫20min取出,立即冷卻至室溫。在490nm波長處測定吸光度,以吸光度值為縱坐標(biāo),葡萄糖含量為橫坐標(biāo),得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=18.36X-0.0198(r=0.9991),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出多糖含量。式中,W為多糖質(zhì)量,C為多糖稀釋液中葡萄糖質(zhì)量濃度,D為稀釋因素,F為換算因子。2.4正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)對(duì)提取溫度(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)3個(gè)因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)(表1),確定最佳的提取工藝,并對(duì)最佳工藝進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)考察。同時(shí)將其與堿提取工藝和超聲輔助提取工藝進(jìn)行比較。2.4.1提取工藝的影響正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。根據(jù)表3的方差分析來看,A,B,C影響大小順序?yàn)锳>B>C,提取溫度影響最大、最顯著,其次為料液比,提取時(shí)間影響最小。最佳提取工藝為A3B3C1,即提取溫度為90℃,料液比為1∶20,提取時(shí)間為1h,但此條件在正交表中并沒有出現(xiàn)。2.4.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析同樣對(duì)提取工藝中的提取溫度、料液比和提取時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn),其試驗(yàn)結(jié)果說明(表4,5)各個(gè)因素的影響大小順序?yàn)锳>B>C,即提取溫度影響最大,從極差分析中可以看出最優(yōu)提取溫度80℃;其次為料液比1∶20,提取時(shí)間影響不大,最優(yōu)提取時(shí)間4h。最佳提取條件為提取溫度80℃,料液比1∶20,提取時(shí)間4h。2.4.3不同提取溫度、時(shí)間對(duì)黃油多糖提取的影響對(duì)黃柏多糖熱水浸提法中的提取時(shí)間、料液比和提取時(shí)間進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),其正交結(jié)果說明(表6,7)對(duì)于黃柏多糖提取來說,其提取溫度影響最顯著,其次為料液比,而提取時(shí)間影響不大。各因素的影響大小順序?yàn)锳>B>C,其最佳提取組合為A3B2C3,溫度90℃,料液比1∶10,提取時(shí)間4h,此最佳條件也沒有包括在正交試驗(yàn)中。2.4.4最佳提取工藝的確定采用最佳提取工藝參數(shù)進(jìn)行提取驗(yàn)證,并進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)確定工藝的穩(wěn)定性。結(jié)果證明,通過正交試驗(yàn)得到的最佳提取工藝中,川芎多糖提取率為5.60%;赤芍多糖提取率為6.12%;黃柏多糖提取率為3.78%,通過重復(fù)性試驗(yàn)表明其3種多糖的最佳提取工藝的重復(fù)性和精密性均良好。2.4.5關(guān)指標(biāo)測定結(jié)果通過3種中藥多糖的最優(yōu)工藝提取多糖并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測定,結(jié)果見表8。表8結(jié)果表明,不僅3種多糖通過熱水浸提法所得到的提取因素存在差異,同時(shí)得到的多糖相關(guān)指標(biāo)也是存在差異的。2.4.6不同提取方法對(duì)于熱水浸療法的效果分析采用堿法提取和超聲輔助提取法進(jìn)行3種多糖的提取,并進(jìn)行硫酸-苯酚法測定其多糖的含量,以及其水溶性比較,結(jié)果見表9~11。結(jié)果表明,川芎和赤芍多糖不同提取工藝中,熱水浸提法具有比較好的效果,各個(gè)指標(biāo)均優(yōu)于其他2種方法。而黃柏多糖提取中,堿法提取效果略好,可能原因在于在黃柏多糖中適合堿提的多糖占優(yōu)勢,且堿法提取的黃柏多糖相對(duì)分子質(zhì)量較小,水溶性較高。從3種多糖的3種工藝來分析,熱水浸提法對(duì)于3種多糖的混合提取的可能性最大。3不同提取工藝對(duì)3種多糖最佳提取條件的優(yōu)化關(guān)于多糖含量方面的差異主要存在兩方面的原因:3種中藥的多糖含量本身有差異,川芎藥材中多糖含量為23.56%;赤芍藥材中多糖含量41.74%;黃柏藥材中多糖含量僅為6.94%,差異比較明顯。植物多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜,種類繁多,不同的多糖提取工藝對(duì)多糖提取率和多糖含量也會(huì)有不同,如趙宇等根據(jù)多糖的結(jié)構(gòu)不同,考慮在水提取液中加堿來提取含有糖醛酸的多糖,從而提高多糖得率。而多糖的溶解度的主要受到多糖分子間氫鍵的相互作用以及分子質(zhì)量大小的影響,同時(shí)不同類別的多糖其溶解性也是不同的,如酸性多糖不溶于熱水。對(duì)于這3種多糖來說熱水浸提得到的多糖分子質(zhì)量大小和交聯(lián)程度存在一定差異,同時(shí)多糖性質(zhì)和多糖中存在的雜質(zhì)都影響3種多糖的溶解性。本次研究通過3種中藥多糖的熱水浸提提取工藝進(jìn)行正交設(shè)計(jì)對(duì)提取溫度、料液比和提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明:3種多糖提取工藝中,其提取溫度均具有顯著的影響,其次為料液比和提取時(shí)間;川芎多糖最佳提取條件為提取溫度90℃,料液比1∶20,提取時(shí)間1h;赤芍多糖最優(yōu)工藝為提取溫度80℃,料液比1∶20,提取時(shí)間4h;黃柏多糖的最佳提取工藝為提取溫度90℃,料液比1∶10,提取時(shí)間4h,且最佳工藝具有良好的精密度和穩(wěn)定性。同時(shí)根據(jù)其提取工藝不同指標(biāo)并綜合提取率等提取結(jié)果分析,最適合的混合提取工藝為提取溫度90℃、料液比1∶20、提取時(shí)間4h。堿法提取中藥多糖中堿溶液有助于解除植物細(xì)胞壁聚合物分子間的物理和化學(xué)的相互作用,從而提高多糖產(chǎn)率。超聲波提取則利用超聲波具有空化效應(yīng)和其他效應(yīng),這些效應(yīng)增加了介質(zhì)的相互反應(yīng),有利于使植物中的有效成分的轉(zhuǎn)移