異丙酚對家兔心肌鈣穩(wěn)態(tài)的影響

異丙酚對家兔心肌鈣穩(wěn)態(tài)的影響

在心臟疾病的保護下，心臟必須經(jīng)歷先鋒劑的缺乏和其他損失。如果血液回流后心力衰竭，心肌細胞就無法立即恢復(fù)。該機制主要涉及氧自由基受損和心臟微細胞鈣超載。越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)心肌細胞線粒體基質(zhì)鈣穩(wěn)態(tài)能力恢復(fù)對再灌注后心功能的恢復(fù)起著重要的作用。有文獻報道靜脈麻醉藥異丙酚可以影響心肌細胞的鈣離子內(nèi)流,也有文獻報道異丙酚對心肌缺血/再灌注損傷具有一定的保護作用。機制可能是直接影響再灌注損傷時細胞鈣超載的形成或通過其本身對抗氧自由基的功能起到對心肌的保護作用。本研究擬進一步觀察異丙酚是否可以對心肌缺血/再灌注損傷時線粒體的鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生影響。材料和方法1.主動脈灌注rog健康成年新西蘭大白兔24只(體重1.9~2.2kg)隨機分為對照組(C組)、停跳缺血組(I組)、異丙酚停跳缺血組(P組)和高濃度異丙酚停跳缺血組(PH組),每組6只。腹腔注射25mg/kg的硫噴妥鈉麻醉后肝素化,迅速剪開胸腔取下心臟用改良的Langendorff裝置立即進行主動脈逆行灌注。其中P組和PH組的灌注液分別含有50μmol/L和200μmol/L的異丙酚(捷利康公司)待心率血壓穩(wěn)定后(約灌注開始后20min)C組心臟繼續(xù)在恒溫(37±0.2)℃和恒定的灌注壓(7.84kPa)下持續(xù)灌注90min。I組、P組和PH組停止灌注并迅速經(jīng)主動脈根部注入20ml的高鉀停搏液(4℃)使心臟停止跳動,并將心臟浸于8℃~14℃的生理鹽水中,每隔20min重復(fù)注射一次停搏液。心臟在停止灌注60min后,恢復(fù)停搏前的灌注(均能正常復(fù)跳)。再灌注30min。2.超微電鏡sem和染色體分離灌注結(jié)束后,將心臟取下迅速浸入0℃的勻漿介質(zhì)中(成分:225mmol/L的甘露醇,75mmol/L的蔗糖,1mmol/L的EDTA,0.25%的牛血清白蛋白,pH7.4),切取一小塊心肌組織(心尖部)做超微電鏡分析。其余部分心肌剪碎后進行勻漿并用差速分離的方法分離線粒體,分離過程中保證線粒體的溫度不超過4℃。線粒體的洗滌液和終溶液均為0℃的180mmol/L的氯化鉀溶液。最后線粒體沉淀制成2ml的懸液。3.色度、離心與懸液的制備用微量移液器抽取10μl的1mmol/LFura2-AM(sigma公司)加入線粒體懸液中,將線粒體懸液在37℃水浴中靜置15min。15min后加入10倍體積的0℃180mmol/L的KCl在低溫離心機內(nèi)10000g離心3min后棄上清留沉淀。重復(fù)一次洗滌后將線粒體溶于2ml的冰KCl中制成懸液。并用Bradford的方法進行蛋白定量。4.實際熒光值測試分別取0.1ml的線粒體懸液加入5管測試介質(zhì)液(測試介質(zhì)液成分:120mmol/L的KCl,10mmol/L的MOPS,5mmol/L的glamate,5mmol/L的malate,pH7.0)中制成2ml的測試體系,在37℃水浴中溫育5min。這5個測試管分別用于測量正常熒光值F,線粒體破膜(用0.1%TitonX-100)后的飽和鈣(加入2.5mmol/L的CaCl2)及無鈣(加入EGTA絡(luò)合)的熒光值Fmax和Fmin,線粒體攝鈣(加入0.5mmol/L的CaCl2)后熒光值Fu和釋鈣(加入10mmol/L的NaCl和1.0μmol/L的釕紅)后的熒光值Fr。熒光測定在日立800型熒光分光光度計上完成,激發(fā)波長340nm和380nm,發(fā)射波長505nm,激發(fā)光柵5nm,發(fā)射光柵10nm。再根據(jù)文獻的方法結(jié)合熒光值和蛋白濃度計算出線粒體基質(zhì)的游離鈣濃度(單位:nmol/mg蛋白)。以上步驟3和4均在避光的條件下完成。資料結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)的形式表示,在檢驗方差齊性的基礎(chǔ)上采用方差分析進行數(shù)據(jù)處理(由SPSS軟件完成),P<0.05認為有顯著性差異。c組與c組的差異基因經(jīng)歷缺血/再灌注的I組、P組和PH組的線粒體基質(zhì)游離鈣濃度均顯著高于C組。但I組、P組和PH組三組之間的基質(zhì)游離鈣濃度沒有顯著差別。當(dāng)線粒體懸浮于遠高于胞漿所能達到的高鈣(0.5mmol/LCaCl2)測試介質(zhì)液中時,四組線粒體游離鈣濃度均開始升高,C組的基質(zhì)游離鈣濃度仍顯著低于其它三組,但四組攝取鈣的絕對值卻沒有顯著差別。當(dāng)四組線粒體懸浮于含鈉離子(10mmol/L)和線粒體攝鈣的抑制劑釕紅的測試介質(zhì)中時,四組線粒體基質(zhì)游離鈣濃度均明顯下降,C組釋放鈣的量明顯少于其它三組。I組、P組和PH組的超微電鏡均顯示線粒體水腫,I組的線粒體內(nèi)有較多的黑色的高電子密度沉淀,而PH組則鮮見這種高電子密度沉淀(圖1、2)。家兔土地內(nèi)的鈣離子含量和組成變化fura2-AM是一種熒光指示劑,可以以脂溶形式透過線粒體內(nèi)膜并分解成游離酸形式與游離的鈣離子結(jié)合使其激發(fā)波長由380nm移至340nm從而通過熒光變化測量游離鈣離子的濃度。鈣離子是目前所知唯一能夠穿過線粒體內(nèi)膜傳達激素信號的胞內(nèi)第二信使,在生理情況下,鈣離子在0~4nmol/mg蛋白的濃度范圍內(nèi)。游離鈣離子在線粒體內(nèi)調(diào)控ATP的產(chǎn)生,因而其濃度對線粒體產(chǎn)能功能有著重要的調(diào)控作用。同時還對胞漿鈣離子濃度起穩(wěn)定作用。在心肌缺血階段,線粒體的氧化磷酸化能力迅速下降,即使在心肌保護液的作用下,ATP的產(chǎn)量也下降。此時線粒體基質(zhì)鈣離子濃度已有升高,但此時鈣離子進入線粒體的途徑并不明確。當(dāng)心肌恢復(fù)氧供(再灌注)時,細胞內(nèi)產(chǎn)生大量的氧自由基和鈣離子濃度升高出現(xiàn)鈣超載。此時線粒體開始利用內(nèi)膜兩側(cè)的電位差攝取鈣離子和合成ATP,并且二者產(chǎn)生了競爭。線粒體優(yōu)先利用氧化磷酸化建立的內(nèi)膜兩側(cè)電位差攝取鈣離子,而不能產(chǎn)生大量的ATP。由表中可以看出I組、P組和PH組的線粒體游離鈣濃度明顯高于C組。目前越來越多的實驗研究證實是線粒體的鈣超載而不是細胞漿的鈣超載伴隨著缺血再灌注損傷。線粒體鈣超載產(chǎn)生再灌注損傷的重要機制之一就是線粒體基質(zhì)鈣濃度升高致使線粒體內(nèi)膜開放一種滲透性轉(zhuǎn)運孔道(mitochondrialpermeabilitytranstition,MPT)開放,從而可使達1500道爾頓的分子或離子可以通過線粒體內(nèi)膜干擾線粒體的產(chǎn)能影響心功能。心肌線粒體這種非特異性孔道開放也被認為是心肌缺血/再灌注損傷的主要機制之一。線粒體基質(zhì)鈣超載是這種非特異性孔道開放的重要原因,尤其是伴有氧自由基的情況下。靜脈麻醉藥異丙酚具有抑制這種非特異性孔道開放的能力,但其機制至今尚未完全闡明。由于基質(zhì)鈣超載是線粒體非特異性孔道開放的重要原因,而異丙酚對細胞膜的鈣內(nèi)流有抑制作用,因而可能對線粒體內(nèi)膜的鈣轉(zhuǎn)運也會有影響。已有研究證明異丙酚濃度在150μmol/L以上時可以影響肝線粒體對鈣離子的攝取。但也有文獻認為異丙酚主要是通過其氧自由基的清除作用來抑制非特異性孔道的開放。本研究采用熒光的方法直接測定缺血/再灌注后家兔心肌線粒體的基質(zhì)鈣濃度,攝取和釋放鈣離子的能力。發(fā)現(xiàn)在臨床誘導(dǎo)峰濃度(50μmol/L,P組)和4倍的臨床誘導(dǎo)峰濃度(200μmol/L,PH組)的異丙酚劑量作用下的心肌線粒體與未用異丙酚同樣經(jīng)歷缺血再灌注的心肌線粒體(I組)相比,基質(zhì)鈣濃度并沒有顯著差別。當(dāng)線粒體懸浮于高鈣溶液時,三組的攝取值同樣沒有顯著差別。同時與正常對照組相比也沒有顯著差別,可能在高鉀停搏液的保護下,30min后線粒體已停止再灌注初期的病理性攝鈣。當(dāng)線粒體懸浮于含鈉和特異性的鈣離子攝取抑制劑釕紅的測試介質(zhì)液中時,可見三組線粒體表現(xiàn)出了明顯的釋鈣能力,釋鈣量與C組相比有顯著差別,并且可以將游離鈣濃度降至正常的范圍內(nèi)。這說明在再灌注的恢復(fù)階段,隨著胞漿通過鈣-鈉交換降低胞漿鈣離子濃度的同時,線粒體也可以通過與胞漿的鈣-鈉交換途徑降低其游離鈣濃度從而實現(xiàn)其功能的恢復(fù)。三組線粒體超微電鏡可以觀察到I組的線粒體內(nèi)有以磷酸鈣鹽為主的二價陽離子致密黑色沉淀物。這主要是由于非特異性孔道開放使得大量無機磷等小分子可以透過內(nèi)膜進入基質(zhì)與高濃度的鈣離子結(jié)合形成沉淀。而P組,尤其