離體花粉小孢子發(fā)育途徑

離體花粉(小孢子)發(fā)育途徑一、花粉的發(fā)育階段花粉是花粉粒的總稱，花粉粒是由小孢子發(fā)育而成的雄配子體。為了理解培養(yǎng)條件下的小孢子發(fā)育，有必要首先理解小孢子的正常發(fā)育狀況。以被子植物為例，正常條件下雄蕊的花藥中可分化出孢原組織，孢原組織進行平周分裂形成造孢細胞，再進一步分化為小孢子母細胞(普通稱為花粉母細胞，染色體數(shù)為2n，花粉母細胞經(jīng)減數(shù)分裂由一種細胞形成4個細胞(四分體時期)。每個細胞就是一種單倍的小孢子(單核花粉)，四分體的4個單倍體細胞彼此分離，形成4個含有單細胞核的花粉粒，此時的細胞含有濃厚的細胞質(zhì)，核位于細胞中央，即單核居中期；之后單核小孢子的核由于細胞質(zhì)的液泡化，被大液泡擠壓到萌發(fā)孔相對的一邊，這就是所謂的單核靠邊期；緊接著進行第一次有絲分裂，成為二核小孢子，其中稍大的一種為花粉管細胞核(營養(yǎng)核)，較小的一種為生殖核，第二次有絲分裂是生殖核的分裂。這樣就形成有三個核的成熟花粉粒(雄配子體)(圖5-2)。植物的種類不同，第二次有絲分裂的時間也不同，某些植物在開花、授粉之前只進行一次有絲分裂。只有發(fā)育到二核花粉時期，它們的第二次有絲分裂是在授粉之后，花粉管萌發(fā)、生殖核進入花粉管后才進行分裂的。圖5-2花粉的發(fā)育階段二、離體小孢子的發(fā)育途徑正常條件下，花粉發(fā)育過程都要通過一次不均等的胞質(zhì)分裂，形成一種較小的生殖細胞和一種較大的營養(yǎng)細胞，稱為A型途徑。在離體條件下，由于外界環(huán)境的變化，小孢子的初次分裂除了出現(xiàn)不均等分裂外，偶然也發(fā)生不對稱分裂機制受到破壞的狀況，即花粉第一次有絲分裂時，細胞核在比較靠近小孢子的中心開始有絲分裂，從而發(fā)生對稱的胞質(zhì)分裂，最后產(chǎn)生兩個相等細胞的花粉粒。這種對稱胞質(zhì)分裂的異常發(fā)育類型稱為B型途徑，在大麥、煙草等作物的花藥培養(yǎng)中能夠見到。(一)花粉不均等分裂途徑(A型途徑)當小孢子的第一次有絲分裂為不均等分裂時，形成一種較小的生殖細胞和一種較大的營養(yǎng)細胞，在培養(yǎng)條件下，由于變化了花粉原來的生活環(huán)境，花粉的正常發(fā)育途徑受到克制，花粉第二次分裂不再像正?；ǚ郯l(fā)育那樣由生殖核再分裂一次形成兩個精子核，而是像胚細胞同樣持續(xù)分裂增殖。這時花粉的分裂增殖方式有4種類型(圖5-3)。圖5-3小孢子正常發(fā)育途徑和培養(yǎng)條件下胚胎發(fā)育途徑的比較(Reinertetal.，1977，略有修改)1．營養(yǎng)細胞發(fā)育途徑(A-V途徑)花粉經(jīng)第一次有絲分裂形成不均等的營養(yǎng)核和生殖核，其生殖核較小，普通不分裂或分裂幾次就退化，而較大的營養(yǎng)核經(jīng)多次分裂而形成多細胞團，并快速增殖突破花粉壁形成胚狀體或愈傷組織，最后再生成單倍體植株。2．生殖細胞發(fā)育途徑(A-G途徑)營養(yǎng)核分裂1次或2次后退化，而生殖核經(jīng)多次分裂發(fā)育成多細胞團，最后再生成單倍體植株。3.營養(yǎng)細胞和生殖細胞并進發(fā)育途徑(E途徑)營養(yǎng)核與生殖核各自分裂形成單倍體愈傷組織或胚狀體，最后形成單倍體植株。4．營養(yǎng)核與生殖核融合發(fā)育途徑(C途徑)營養(yǎng)核與生殖核融合后再分裂，最后形成二倍體或者多倍體植株。(二)花粉均等分裂途徑(B型途徑)花粉進行均等分裂形成兩個均等的子核，這種分裂方式也存在兩種狀況，一是均等的子核各自分裂形成單倍體愈傷組織或胚狀體，最后形成單倍體植株。二是小孢子均等分裂形成兩個大致相等的子細胞，這兩個細胞發(fā)生第二次有絲分裂后發(fā)生核融合，并繼續(xù)分裂形成多細胞團，破壁后形成胚狀體或愈傷組織，最后形成多倍體胚。即使花粉在離體培養(yǎng)下存在不同的發(fā)育方式，但在某一具體植物的花藥培養(yǎng)中可能出現(xiàn)一種或兩種以上的不同發(fā)育方式。三、雄核發(fā)育啟動的機理花粉是產(chǎn)生花粉植株的原始細胞，其第一次有絲分裂在本質(zhì)上與合子的第一次孢子體分裂相似，把花粉形成植株的途徑稱為花粉孢子體發(fā)育途徑，也稱為雄核發(fā)育途徑。為了對單倍體誘導進行遺傳操作和控制，人們對雄核發(fā)育啟動的機理始終很感愛好。在研究早期，人們發(fā)現(xiàn)植物中存在一種不正常的花粉含有胚胎發(fā)生潛力，后來人們又發(fā)現(xiàn)不正?；ǚ鄄⒉皇腔ǚ叟叩奈ㄒ换蛑匾膩碓础ｋx體條件下，在外界環(huán)境的誘導下，花粉能夠變化其正常發(fā)育途徑轉(zhuǎn)入雄核發(fā)育途徑，在這個過程中，細胞內(nèi)的基因體現(xiàn)和生理生化反映均發(fā)生了對應的變化。歸結(jié)雄核發(fā)育啟動的機理，大致能夠分為下列三點。(一)雄核發(fā)育與P-花粉Sunderland等在煙草和雜種牡丹的活體花粉和離體培養(yǎng)的花藥中發(fā)現(xiàn)，在一種植物種或品種的花粉群體中出現(xiàn)正常和非正常兩種類型花粉粒的現(xiàn)象，稱為花粉的二型性。正?；ǚ鄣陌l(fā)育可劃為單核小孢子早期、單核小孢子晚期、花粉第一次有絲分裂期、2細胞花粉早期和2細胞花粉晚期(成熟期)5個時期。異?；ǚ墼趩魏诵℃咦油砥陂_始分化，其中大部分逐步停止發(fā)育，少數(shù)(不超出100)可在體內(nèi)啟動雄核發(fā)育途徑，朝著形成孢子體的方向發(fā)展，這類花粉比正?；ǚ哿Ｐ　⒓毎|(zhì)染色淺、發(fā)育緩慢，具胚胎發(fā)生潛能，是在培養(yǎng)前由作用于活體的因素所預先決定的，離體花粉只是起孢子體發(fā)育的觸發(fā)作用和維持相繼生長的作用，稱為P-花粉(Sunderland,1978)，又稱為S-花粉或E-花粉，或不染色花粉(NS-花粉)，也稱為小花粉。在正常條件下，也有少數(shù)活體小孢子由于所處的局部條件的變化(涉及遺傳方面的或生理上的變化)變化了它們的正常發(fā)育途徑，形成不正常發(fā)育的花粉，如果在適宜時期將這些小孢子進行培養(yǎng)，這些小孢子比其它正常發(fā)育小孢子更易于接受培養(yǎng)條件的影響，在離體條件下形成花粉胚。不正?；ǚ鄄⒉皇腔ǚ叟叩奈ㄒ换蛑匾膩碓矗亲匀话l(fā)生的不正?；ǚ叟c離體培養(yǎng)誘導的發(fā)育早期的花粉胚含有明顯的相似性，在已得到大量花粉胚的茄科和禾本科植物中都發(fā)現(xiàn)有花粉二型性。(二)逆境解決對雄核發(fā)育的誘導處在誘導適宜期的小孢子在受到脅迫因素誘導時，正常的花粉發(fā)育途徑即會變化而轉(zhuǎn)向雄核發(fā)育途徑。大麥、油菜、小麥和煙草被認為是研究脅迫誘導雄核發(fā)育的模式植物。從這些模式系統(tǒng)的研究中能夠看出，變化小孢子發(fā)育命運的脅迫誘導因素常取決于物種和種內(nèi)的基因型。1．熱激解決熱激解決在甘藍型油菜中應用最普遍，32℃解決8h以上才干有效地誘導孤雄生殖，如果在32℃的條件下解決不到4h就轉(zhuǎn)移到常溫下培養(yǎng)，孤雄生殖的誘導過程會被中斷。32℃的溫度解決對甘藍型油菜是必需的，這個溫度幾乎靠近花粉的致死溫度(普通致死溫度為35～37℃或37℃以上)(Smykaletal.，)。有趣的是，供體植株生長的溫度與花藥培養(yǎng)時熱激解決的溫度最少應有5℃的差別，這個差別越大，熱激解決的效果越明顯。對于十字花科植物，高溫解決有效地提高了小孢子核對稱分裂的頻率，使部分小孢子在第一次核分裂過程中偏離原配子體的發(fā)育模式而向孢子體方向發(fā)育。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)逆境有增進孤雄生殖的效果，但對其機制理解甚少。發(fā)現(xiàn)一種小熱激蛋白(smHSP)在熱激解決時轉(zhuǎn)錄增加，可能與熱激誘導孤雄生殖有關(guān)。2．物理或化學解決γ射線對小孢子胚胎發(fā)生也含有刺激作用，特別是與熱激解決相結(jié)合時。最有效的解決是在5rad/min的低照射率，總劑量為500rad的狀況下。花藥培養(yǎng)前用γ射線照射增進花粉愈傷組織形成和花粉胚胎發(fā)生在煙草、小麥、水稻和油菜中都有報道。秋水仙素解決比γ射線解決的效果明顯，但不如熱激解決，在培養(yǎng)基中添加25～50umo1/L秋水仙素，對小孢子和花粉解決48h，能夠收到較好的效果(Zakietal.，1995)。秋水仙素的作用被認為擾亂了對不對稱分裂起決定作用的微管細胞骨架，使單核花粉的細胞核移向中央，造成均等分裂。3．低溫解決低溫是另一種增進小孢子胚胎發(fā)生的辦法，對多數(shù)物種來講，花藥／花粉在低溫(4～13℃)解決一段時間再轉(zhuǎn)移到25℃培養(yǎng)能增進孤雄生殖。最適低溫解決時間的長短隨溫度、花粉發(fā)育時期和基因型而變化。在水稻的花藥培養(yǎng)中，普通需要將取回的幼穗在4℃或其它較低的溫度下解決一段時間，再進入培養(yǎng)程序，能獲得較抱負的效果。低溫預解決的作用機理可能有下列幾個方面：①低溫解決可能引發(fā)花藥、花粉內(nèi)源激素、mRNA、糖類、蛋白質(zhì)含量發(fā)生變化，從而阻斷了花粉原來的發(fā)育方向，使其由配子體的發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體的發(fā)育途徑。②提高小孢子的生活力，延緩退化速度，從而提高了誘導率。③引發(fā)小孢子孤立化，即小孢子從花藥中分離。由于在低溫解決過程中，花藥內(nèi)薄壁細胞和絨氈層逐步退化，從而切斷了母體組織與小孢子之間的聯(lián)系。無論哪種機理，成果是預解決能增進花粉啟動，提高誘導率和再生。④產(chǎn)生特定的蛋白質(zhì)。冷解決時，在玉米花藥中產(chǎn)生并積累了一種分子質(zhì)量為32kDa的MAR32蛋白。冷解決7d后MAR32的積累量與隨即的胚狀體產(chǎn)量呈正有關(guān)。4．營養(yǎng)饑餓解決饑餓解決也是增進小孢子胚胎發(fā)生的一種辦法，在25℃條件下對煙草小孢子饑餓解決，或有糖存在的狀況下以33～37℃熱激均能使小孢子實現(xiàn)胚胎發(fā)生，并且，將糖饑餓與熱激解決結(jié)合起來含有一定加性效應(Touraevetal.,1996)。近來在大麥的研究發(fā)現(xiàn)，\o"肌醇"肌醇、鈣和脫落酸脅迫都有刺激小孢子胚胎發(fā)生的效果(Hoekstraetal.,1997)。Aruga等(1985)將煙草花藥放在無糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)幾天克制了小孢子的正常發(fā)育途徑，啟動了孤雄生殖途徑。糖饑餓解決后再轉(zhuǎn)移到含糖培養(yǎng)基上使生殖細胞核合成DNA的能力喪失，而營養(yǎng)細胞核在糖饑餓的狀況下卻獲得了合成DNA的能力。Zarsky等(1990)推測，在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)之前對花粉進行饑餓解決，可能使雄配子體細胞質(zhì)受克制，啟動營養(yǎng)細胞分化，使營養(yǎng)細胞脫離G1狀態(tài)而進入細胞周期的S期，這一過程是小孢子向胚性發(fā)展所必需的。5．重金屬脅迫重金屬脅迫能夠提高玉米花培效率。將玉米花藥接種在添加了0.25～1.0mmol/L的NiC12,CdC12,ZnCl2的誘導培養(yǎng)基中解決1～14d，然后轉(zhuǎn)移到正常誘導培養(yǎng)基中，成果表明，對含有花藥培養(yǎng)能力的基因型而言，三種重金屬鹽均能明顯影響其培養(yǎng)效率，其中以0.5mmol/L解決1d效果最佳，但對無花藥培養(yǎng)能力的基因型無效(姜麗君等，1998)。(三)雄核發(fā)育啟動的分子機理處在誘導條件下的小孢子在受到外界因素誘導時，正常的花粉發(fā)育途徑即會變化而轉(zhuǎn)向雄核發(fā)育途徑。在這個過程中，細胞內(nèi)的基因體現(xiàn)和生理生化過程均發(fā)生了對應的變化。有關(guān)雄核發(fā)育啟動特異性或有關(guān)基因的研究已有一定進展，但現(xiàn)在分離得到的基因仍然只能說是花粉或胚特異性的基因，還難以斷定與雄核發(fā)育啟動有關(guān)。甘藍型油菜單倍體胚胎發(fā)生的前8h，有大概18種蛋白質(zhì)以很高的頻率合成(Cordeweneretal.，1994)。熱激誘導早期熱激蛋白Hsp70在甘藍型油菜小孢子胚胎發(fā)生中有明顯上升體現(xiàn)，Hsp70在胚性小孢子中明顯高于正常小孢子。蛋白質(zhì)的修飾(如\o"水質(zhì)磷酸鹽（標樣）"磷酸化和甲基化)可能比基因產(chǎn)物的存在與否更重要。諸多基因僅僅在花粉第一次有絲分裂后體現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)錄活性(Bedinger,1992)，甘藍型油菜孤雄生殖能力的缺失與所謂“晚期基因”的體現(xiàn)相吻合?！巴砥诨颉痹诨ǚ鄣谝淮斡薪z分裂后活躍轉(zhuǎn)錄，是花粉萌發(fā)和受精過程所必需的。有些花粉特異性基因的下降調(diào)控與