植物總RNA的提取及RT-PCR

植物總RNA的提取及RT-PCR生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

植物總RNA的提取及RT-PCR

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

1.學(xué)習(xí)從植物組織中提取總RNA的方法

2.了解RT-PCR的基本原理和實(shí)驗(yàn)方法

二、實(shí)驗(yàn)原理

1.RNA提取的原理

RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的RNA，必須最大限度地抑制提取過(guò)程中內(nèi)源性及外源性核糖核酸酶對(duì)RNA的降解。高濃度強(qiáng)變性劑異硫氰酸胍可溶解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細(xì)胞中釋放出來(lái)時(shí)不被降解。細(xì)胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片，通過(guò)酚、氯仿等有機(jī)溶劑處理得到純化、均一的總RNA。

2.RT-PCR的原理

提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因和合成cDNA探針等。

三、儀器、藥品與試劑配方

(一)儀器及器皿

1．低溫離心機(jī)；2．瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)；3．高壓滅菌鍋；

4.PCR儀；5．研缽；6.一次性手套等；

7.離心管；8.培養(yǎng)皿；9.燒杯及試劑瓶等。

(二)藥品

1.焦碳酸二乙酯(DEPC)2.異硫氰酸胍(GT)3.醋酸鈉(NaAc)

4.苯酚5.異丙醇6.氯仿

7.乙醇8.β－巰基乙醇9.瓊脂糖

10.MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒11.TaqDNA聚合酶12.引物

(三)試劑配制

1．0.1%DEPC水滅菌

2.4mol/L異硫氰酸胍

3.2mol/LNaAc（pH4.8）滅菌

4.3mol/LNaAc（pH4.8）滅菌

5.4mol/LLiCl滅菌

6.1×TE緩沖液：10mMTris-HCl（pH8.0），1mMEDTA（pH8.0）,滅菌。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）總RNA的提取

（1）研缽冷卻后，倒入2/3液氮，加入0.2g植物材料，充分研磨后轉(zhuǎn)入一個(gè)含有300

l的4MGT的1.5ml的聚丙烯管中，搖勻。

（2）加入30l2MNaAc（pH4.9-5.2）搖勻，加入300l酸酚（水飽和酚pH5.0），

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

搖勻，加入100l三氯甲烷，搖勻。

（3）120XX年rpm4℃離心20min，吸取上清，加入等體積異丙醇，于冰上放置15min。

（4）120XX年rpm4℃離心10min，將沉淀懸浮于含100l4M氯化鋰的1.5mlEP管

中，于-20℃放置1小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。

（5）120XX年rpm4℃離心10-15min，將沉淀溶于0.4mlDEPC水中，加入1/2體積

氯仿和1/2體積酸酚，搖勻，進(jìn)行抽提，120XX年rpm4℃離心5min；上清加入等體積氯仿，搖勻，進(jìn)行抽提，120XX年rpm4℃離心5min。

（6）上清液加入1/10體積的3M乙酸鈉和兩倍體積的無(wú)水乙醇于-20℃放置1小時(shí)或

更長(zhǎng)時(shí)間。

（7）120XX年rpm4℃離心15min，超凈臺(tái)吹干，沉淀溶于10lb滅菌的DEPC水中。

（8）RNA貯于-80℃。

（二）RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA

在DEPC處理過(guò)的離心管中冰上按下表加入：

模板RNA

Olig(dT)18

DEPC水2l1l2l

混勻，70℃水浴中放置2min，立即放置到冰上2min。然后在冰上依次加入：

RNasin

M－MLV

5×buffer

10mMdNTP0.5l1l2l1.5l

42℃，水浴中反應(yīng)90min。72℃，10min，終止反應(yīng)。

加入15l的DEPC滅菌水，使總體積達(dá)到25l。

(三)PCR

1.在滅菌的PCR管中加入以下成分，形成PCR反應(yīng)體系

10Xbuffer2.5l

dNTP(2.5mmol)2l

RT-PCR產(chǎn)物5l

Taq酶0.5l

上游引物（10mol/l）0.5l

下游引物（10mol/l）0.5l

滅菌ddH2O加到25l

2.按照下列條件進(jìn)行PCR反應(yīng)

94℃5min

94℃30s

55℃30s

72℃1min

30個(gè)循環(huán)

72℃7min

4℃

（四）電泳檢測(cè)

將加EB的1%變性瓊脂糖凝膠放入水平電泳槽中，加1×TE電泳緩沖液，覆蓋凝膠約1mm。將RNA及DNA樣品加到凝膠點(diǎn)樣孔中，85V條件下電泳30min，在紫

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外燈下觀察結(jié)果。

五、注意事項(xiàng)

1．在研磨過(guò)程中，利用液氮時(shí)刻使組織保持冰凍狀態(tài)。

2．RNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶類，除了細(xì)胞內(nèi)源RNA酶外，外界環(huán)境中均存在RNA酶，所以操作時(shí)應(yīng)戴手套。

3.使用DEPC時(shí)，應(yīng)在通風(fēng)櫥中戴手套操作。

4．RNA提取用品準(zhǔn)備：

1）普通的玻璃器皿：180℃烘干8小時(shí)（玻璃），研缽，小勺，試劑瓶若干個(gè)。

2）一次性使用的塑料制品：槍頭、EP管等先用DEPC水處理然后高壓滅菌，烘干。

3）電泳