液相色譜-串聯質譜法測定水產品中8種青霉素殘留

液相色譜-串聯質譜法測定水產品中8種青霉素殘留

由于其價格低廉、使用方便、抗菌性強，對漁業(yè)生產中毒等疾病的治療被廣泛用于防止魚類、蝦細菌感染和人參疾病的治療。這種抗生素的不適當使用已經成為食品的安全隱患，可能會對水生生產和生態(tài)環(huán)境造成嚴重的潛在危害。我國農業(yè)部235號公告和歐盟指令NO.2377/90/EEC對青霉素類抗生素在動物源性食品中的殘留進行了嚴格限制。青霉素類抗生素殘留的分析方法主要有微生物法、免疫分析法、高效液相色譜(HPLC)法和液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS),其中LC-MS/MS法因可避免生物法在特異性和準確性方面的欠缺,也可彌補液相色譜法定性困難的不足,而成為目前國際上廣泛采用的青霉素殘留分析方法[9,10,11,12,13,14,15,16,17,18]。這些研究涉及畜禽肉、牛奶和蜂蜜等樣品,尚無針對水產品的檢測方法;已有方法通常僅涉及1種青霉素藥物或極性接近的幾種青霉素藥物;均采用較大的樣品量(5g)和提取溶劑量(不低于30mL),對環(huán)境污染較大;且多采用固相萃取(SPE)技術凈化樣品及外標法定量,對樣品的提取過程要求較高,耗時費力。本研究建立了同時測定水產品中8種青霉素抗生素殘留的液相色譜-串聯質譜方法。方法采用分散固相萃取技術凈化樣品,以青霉素G-D7為內標進行定量分析,不僅降低了檢測成本,而且提高了檢測效率及目標物的回收率。此外在前處理時僅需1g樣品和10mL提取溶劑,減少了有機試劑對環(huán)境的污染。該方法操作簡便、取樣量少、分析速度快、靈敏度和準確度高,可滿足水產品中青霉素類抗生素殘留的分析檢測和確證要求。1實驗部分1.1儀器、標準和標準品TSQQuantumAccessTM液相色譜-串聯質譜儀(美國ThermoFisherScientific公司);KQ-300E型超聲波提取儀(昆山市超聲儀器有限公司);XW-80A型旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠);HimacCR22GⅡ型高速冷凍離心機(日本Hitachi公司);N-EVAP112型氮氣吹掃儀(美國Organomation公司);Milli-Q型超純水儀(美國Millipore公司);C18固相萃取柱(500mg,6mL)、OasisHLB固相萃取柱(500mg,6mL)和OasisMAX固相萃取柱(500mg,6mL)。青霉素類抗生素標準品阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、雙氯西林均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司,純度為96%～99%;乙腈(Merck公司)、甲酸(Fluka公司)均為HPLC級;C18吸附劑(230～400目,上海安譜科學儀器有限公司);超純水(18.2MΩ·cm)。1.2混合標準中間液準確稱取8種抗生素標準品各10.0mg,分別置于10mL棕色容量瓶中,用30%乙腈溶液溶解并定容,混勻,配制成1.0g/L的標準儲備溶液,-20℃避光保存。精密量取各標準儲備溶液100μL至10mL棕色容量瓶中,用水稀釋定容,配制成10.0mg/L的混合標準中間溶液,現用現配。準確稱取10.0mg青霉素G-D7,用30%乙腈溶液溶解并定容至50mL棕色容量瓶中,質量濃度為0.2g/L,-20℃避光保存。精密量取100μL青霉素G-D7溶液至100mL棕色容量瓶中,用水稀釋定容,配制成200μg/L的內標工作溶液,現用現配。1.3具塞離心提取稱取勻漿后的樣品1.0g于15mL具塞離心管中,準確加入100μL內標工作溶液和4mL80%乙腈溶液,渦旋混合1min,超聲提取5min。在4℃下以4000r/min離心5min,取上清液于另一15mL具塞離心管中。殘渣中加入4mL80%乙腈溶液,重復提取1次,合并兩次提取液并用80%乙腈溶液定容至10.0mL。向上述提取液中加入500mgC18吸附劑,渦旋混勻,振搖30s,在4℃下以10000r/min離心1min,移取5.0mL上清液于10mL具塞刻度玻璃離心管中,于35℃下氮氣吹至液面低于1mL,用水定容至1.0mL,渦旋混合,用截留相對分子質量為10000的超濾管離心過濾后,濾液供液相色譜-串聯質譜儀測定。1.4流動相及洗脫梯度液相色譜條件:ThermoHyPURITYC18色譜柱(2.1mm×150mm,3.5μm);柱溫:35℃;流速:0.2mL/min;進樣量:10μL;流動相:A為0.1%甲酸,B為乙腈(含0.1%甲酸);洗脫梯度:0～5.0min,2%～100%B;5.0～7.0min,100%B;7.1～10.0min,2%B。質譜條件:電噴霧離子源(ESI),正離子掃描,選擇反應監(jiān)測(SRM),噴霧電壓:5000V,鞘氣壓力:12L/min,輔助氣壓力:2L/min,離子傳輸管溫度:350℃,源內碰撞誘導解離電壓:0V。1.5樣品的淋洗及洗脫將空白樣品的粗提液于37℃旋轉蒸發(fā)除去乙腈,添加適量的混合標準溶液,再加入15mLpH8.0磷酸鹽緩沖溶液,渦旋混勻,待上樣。各小柱用5mL甲醇、5mL水活化后再加入樣品溶液。淋洗及洗脫方法:C18柱用5mL超純水淋洗,8mL乙腈洗脫;HLB柱用4mLPBS(pH8.0)、1mL超純水淋洗,8mL乙腈洗脫;MAX柱用5mLPBS(pH8.0,含5%甲醇)淋洗,8mL5%酸化甲醇洗脫。洗脫后于35℃下氮氣吹干,1mL水定容,進樣分析。2結果與討論2.1有機相的選擇在LC-MS分析中,流動相中有機相多選擇甲醇或乙腈,由于甲醇含有羥基,會加速青霉素降解為青霉噻唑酸酯,故選擇乙腈為有機相。在乙腈-水流動相體系中分別加入5mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸,考察了乙腈-5mmol/L乙酸銨、乙腈-0.1%甲酸和乙腈(0.1%甲酸)-0.1%甲酸3種流動相對分析物離子化效率和色譜峰形的影響(見圖1)。由圖1可見,以乙腈(0.1%甲酸)-0.1%甲酸為流動相獲得了較好的分離效果和色譜峰形。2.2種抗菌劑的分子離子分析將質量濃度為1.0mg/L的8種青霉素混合標準溶液以流動注射的方式分別在正離子(ESI+)、負離子(ESI-)模式下進行母離子全掃描,實驗表明,采用ESI+具有更高的響應值。以正離子模式采集,確定各組分的分子離子峰,分別以其分子離子作為母離子,進行相應的子離子掃描,發(fā)現8種抗生素因分子中含有β-內酰胺環(huán),且基本結構中均有1個游離羧基和酰胺側鏈,故主要發(fā)生CO2丟失、β-內酰胺環(huán)的斷裂以及側鏈上的C—N鍵斷裂,與文獻的報道相吻合。選取豐度最強的碎片離子作為定量離子,次強的碎片離子作為定性離子。以選擇反應監(jiān)測(SRM)正離子模式優(yōu)化噴霧電壓、鞘氣壓力、輔助氣壓力、碰撞能量等質譜參數,優(yōu)化后的質譜條件如表1和“1.4”所示。2.3樣品預處理方法的優(yōu)化2.3.1提取方法的回收率用于青霉素類藥物殘留分析的提取溶劑有磷酸鹽緩沖溶液(pH8.5)、乙腈、80%乙腈溶液等?？疾炝松鲜鋈軇┑奶崛⌒Ч?結果表明,用磷酸鹽緩沖液提取時,回收率低于60%,且水溶性蛋白質含量較高,不利于進一步凈化;用乙腈或80%乙腈溶液作提取劑時,回收率均達90%,但乙腈提取出的雜質較多。以80%乙腈溶液為提取劑時的提取效果最佳,故本實驗選用80%乙腈溶液提取青霉素類藥物殘留。2.3.2結果分析和討論目前,測定動物源性食品中青霉素殘留多采用固相萃取(SPE)的凈化方式,且通常僅針對1種或極性較為接近的幾種青霉素類藥物[8,9,10,15,18,21,22]。根據目標化合物均顯酸性的化學性質,分別考察了C18、OasisHLB和OasisMAX3種SPE柱對分析物回收率的影響(見圖2)。結果顯示,C18柱對青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林的回收率高于70%,對青霉素G、雙氯西林的回收率略低,而對阿莫西林和氨芐西林的回收率不足20%;OasisHLB柱對青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、雙氯西林的回收率良好,對阿莫西林和氨芐西林的回收率較低;OasisMAX柱對8種化合物的回收率均低于60%。因C18和OasisHLB均為反相層析填料,目標化合物的極性越大則在柱上的保留能力越弱,所以C18和OasisHLB柱對強極性的阿莫西林和氨芐西林的回收率偏低;而OasisMAX是用于酸性化合物的混合型陰離子交換反相吸附劑,其對化合物的保留行為與化合物的pKa值相關,化合物的pKa低于吸附環(huán)境的pH值時,化合物呈離子化狀態(tài)而被吸附劑保留。依據文獻,阿莫西林的pKa為2.8和7.2,氨芐西林的pKa為2.7和7.3,其它6種青霉素的pKa均為2.6～2.8,則當MAX柱的吸附環(huán)境在pH7.5～8.0時,即可保證青霉素類藥物的pKa小于吸附環(huán)境的pH值,青霉素類能被保留在MAX填料上,可用酸性甲醇洗脫目標物。但實驗發(fā)現,目標化合物在洗脫至濃縮過程中即發(fā)生降解,回收率低于60%。綜上,8種組分均不能在上述3種SPE柱上同時獲得較高的回收率。分散固相萃取(DSPE)技術是在基質固相分散的基礎上發(fā)展的一種新型凈化方法,該法將吸附劑直接加入提取液中振搖凈化,適用范圍廣,比固相萃取更省時、省試劑,目前此技術已應用于農藥殘留分析。本實驗采用DSPE方法凈化,用C18作固相吸附劑,可去除樣品中的油脂和弱極性雜質,且保證目標物的回收率高于90%,達到了理想的凈化效果,簡化了操作步驟,減少了溶劑用量,有效地縮短了分析時間并節(jié)約了成本。2.3.3提高乙腈的質量采用氮氣吹掃的方式對目標物進行濃縮,升高吹掃溫度可提高濃縮效率但會加速乙腈的揮發(fā),另外也會增加青霉素類藥物的降解。因此,分別在25、30、35、40、45℃條件下進行預實驗,發(fā)現在35℃時樣品溶液的濃縮效率高,同時可保證較高的回收率。2.4不同的生素方法的檢出限和定量下限分別配制一系列標準工作溶液,按“1.4”的條件進行分析,以各青霉素與青霉素G-D7的峰面積之比(y)為縱坐標,各青霉素的質量濃度(x)為橫坐標進行線性回歸分析。采用空白樣品中添加青霉素類抗生素的方法,分別以信噪比S/N≥3、S/N≥10確定檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)。8種青霉素的線性方程、相關系數、檢出限和定量下限見表2。由表2可見,氨芐西林、青霉素G、萘夫西林在1.0～50.0μg/L,青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林在2.5～100.0μg/L,阿莫西林在5.0～200.0μg/L范圍內線性關系良好,相關系數(r)均不低于0.9990,說明本方法適用于青霉素類藥物的定量分析。同時,8種青霉素的檢出限為0.6～3.0μg/kg,定量下限為2.0～10.0μg/kg,方法的靈敏度均滿足我國獸藥殘留監(jiān)控和歐盟對上述獸藥檢測的要求。2.5加標回收率和精密度選用陰性的魚、蝦和海參為空白基質,分別添加低、中、高3個水平的青霉素混合標準溶液,每個水平做6個平行,按本方法進行加標回收率和精密度實驗,結果見表3。由表3可見,8種青霉素的平均回收率為74%～98%,相對標準偏差(RSD)均小于10%,方法的準確度與精密度滿足水產品中多種青霉素類抗生素的殘留分析。2.6不同養(yǎng)殖水產品中激素類抗生素殘留情況應用本方法對市售的草魚、大菱鲆、對蝦、海參等30個養(yǎng)殖水產品進行分析,其中1個樣品中檢出青霉素G,含量為5.61μg/kg,其余樣品中均未檢出青霉素類抗生素殘留