重組人溶菌酶的研究進(jìn)展

重組人溶菌酶的研究進(jìn)展

溶菌酶是一種糖苷水解酶，與n-3-氨基葡萄糖（nag）和n-4-丙烯酸糖苷鍵作用。它可以水解成一些細(xì)菌細(xì)胞中的一些糖苷。這也被稱為c-1和4-n-3-萘甲酸酶。它廣布于人體心、肝、脾、肺、腎等多種器官組織中,在人體內(nèi)與其他激素或維生素以復(fù)合物形式存在。此酶由粒細(xì)胞與單核細(xì)胞持續(xù)合成與分泌,由于它對G+菌有較強(qiáng)的殺菌作用,因此是人體非特異性免疫中一種重要的體液免疫因子。溶菌酶具有各種不同的生理生化作用,包括非特異性防御感染免疫反應(yīng)、凝血作用、間隙連接組織的修復(fù)、參與黏多糖的生物合成代謝及抗菌作用等。長期以來,溶菌酶主要由生物組織中提取,產(chǎn)量低,費用大,易帶來生物污染。重組人溶菌酶(recombinanthumanlysozyme,rHLZ)是用生物工程方法生產(chǎn)的新型溶菌酶,純度高,制備方便?，F(xiàn)綜述抗菌一類新藥rHLZ的臨床前評價的內(nèi)容及結(jié)果,希望對國內(nèi)此類藥物的開發(fā)起到借鑒作用。1主要藥理學(xué)的療效研究1.1rllz在g-菌及耐藥菌中的抗菌作用采用瓊脂二倍稀釋法測定rHLZ對1040株致病菌(包括耐藥菌株)的最低抑菌濃度(MIC值)。體外抗菌試驗結(jié)果表明:rHLZ體外對試驗菌株具有抗菌活性,MIC范圍為0.125～>4000μg·mL-1,對金葡球菌、表皮葡萄球菌活性強(qiáng),尤其對甲氧西林耐藥的金葡球菌(MRSA),甲氧西林耐藥的表皮葡萄球菌(MRSE)及克拉霉素、羅紅霉素等耐藥菌有效。對表皮葡萄球菌的抗菌作用強(qiáng)于對金葡球菌的作用。rHLZ對G-菌中的大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、枸櫞酸桿菌、沙雷菌、銅綠假單胞菌、陰溝腸桿菌等的抗菌作用較弱,多數(shù)菌株的MIC值≥4000μg·mL-1。首先進(jìn)行rHLZ對HeLa細(xì)胞的毒性測定,再進(jìn)行在HeLa細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對冠狀病毒04號的毒力測定。觀察不同濃度rHLZ在HeLa細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對冠狀病毒04號的預(yù)防作用。試驗采用病毒細(xì)胞(CPE)法,計算藥物的半數(shù)有效濃度(IC50)和最小有效濃度(MIC)及治療指數(shù)(TI)。再觀察不同濃度的rHLZ在HeLa細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)對冠狀病毒04號的抑制作用。rHLZ的最大無毒濃度(TD。)為750μg·mL-1,半數(shù)中毒濃度(TD50)為1500μg·mL-1,冠狀病毒04號的半數(shù)感染量(TCID50)為10-3。預(yù)防試驗中,rHLZ的IC50為5.9μg·mL-1,MIC為11.7μg·mL-1,TI為64。在抑制冠狀病毒試驗中,rHLZIC50為23.4μg·mL-1,MIC為46.8μg·mL-1,TI為16。1.1.2小鼠外施巴豆油總黃酮的單次給藥對小鼠耳廓水腫度的影響小鼠外皮中巴豆油誘導(dǎo)耳廓水腫度的單因素試驗,見表1采用小鼠巴豆油致耳廓腫脹試驗檢測rHLZ的抗炎作用。小鼠經(jīng)外涂rHLZ,每只120,60,30IU,對巴豆油誘發(fā)耳廓腫脹度明顯減輕。說明rHLZ具有抗炎作用。1.1.3對大鼠的單次給藥后是否具有鎮(zhèn)痛作用以涂藥前和涂藥后0.5～4h測每只大鼠的疼痛反應(yīng)(甩尾)時間,觀察大鼠涂抹rHLZ后是否具有鎮(zhèn)痛作用。結(jié)果表明,每只大鼠尾巴涂抹rHLZ30,60,120IU后3h內(nèi),其痛閾明顯升高。1.1.4細(xì)菌體內(nèi)感染測定rHLZ對小鼠細(xì)菌感染敗血癥的試驗結(jié)果表明,rHLZ靜脈注射對金葡球菌01193,金葡球菌MSSA022,金葡球菌MRSA028,表皮葡萄球菌MRSE0210,肺炎鏈球菌01182,腸球菌ATCC700802所致小鼠敗血癥的感染具有一定的體內(nèi)療效,其半數(shù)有效量(ED50)依次為41.47,>400,>400,8.42,4.63和150.2mg·kg-1。rHLZ靜脈給藥對MRSE0210和肺炎鏈球菌01182感染小鼠的體內(nèi)療效分別顯著強(qiáng)于克拉霉素4和30倍以上。rHLZ與克拉霉素聯(lián)用,分別可增強(qiáng)克拉霉素單用對金葡球菌MRSA-028,金葡球菌MRSA022,表皮葡萄球菌MRSE210,肺炎鏈球菌01181,腸球菌ATCC700802的體內(nèi)療效19.6,3.1,2.1,18.7和1.5倍。rHLZ對小鼠細(xì)菌性咽喉感染的試驗結(jié)果表明,濃度為0.4,0.2,0.1,0.05,0.025mg·mL-1的rHLZ經(jīng)噴霧給藥(每次100μL,qid),對小鼠咽部感染化膿性鏈球菌01-18-1和金葡球菌MRSABAA-42均具有明顯療效,在給藥d2,d3,d4和d5均明顯地使咽部感染細(xì)菌數(shù)降低,與感染對照組比較有顯著性差異(且療效優(yōu)于克拉霉素、羅紅霉素給藥組)。rHLZ與克拉霉素(1:1)聯(lián)用對小鼠細(xì)菌性咽喉感染的療效與單用克拉霉素比較有顯著性差異。聯(lián)用的最佳濃度為(1.5±0.1)mg·mL-1,在該濃度下,其療效顯著地強(qiáng)于其他各給藥濃度組。2對小鼠一般狀態(tài)及心功能的影響采用小鼠、獼猴為實驗動物模型,觀察了rHLZ對小鼠一般狀態(tài)及行為活動、對小鼠自發(fā)活動、戊四唑誘發(fā)驚厥發(fā)生率、協(xié)調(diào)平衡作用、熱板刺痛值及胃腸推進(jìn)作用。觀察了rHLZ對麻醉獼猴的心率、血壓、呼吸、體溫及心電圖指標(biāo)的影響。小鼠口腔給藥劑量為5,10,20mg·kg-1。獼猴采用累積給藥方法,口腔噴霧給藥劑量為1,5mg·kg-1,累積劑量為6mg·kg-1。研究結(jié)果表明,rHLZ5,10,20mg·kg-1對小鼠一般狀態(tài)及行為活動、中樞神經(jīng)系統(tǒng)無明顯的作用,無鎮(zhèn)痛和催眠的作用。rHLZ10,20mg·kg-1對小鼠胃腸推進(jìn)功能有一定的抑制作用。rHLZ1,5mmg·kg-1對獼猴心率、血壓、呼吸頻率和呼吸深度、心電圖指標(biāo)、體溫?zé)o明顯影響。因此可以認(rèn)為rHLZ對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)無明顯的影響。口腔內(nèi)給大劑量的rHLZ可能對消化功能有一定的影響。3動物分組及添加量采用昆明種小鼠,用氧氣霧化吸入rHLZ凍干粉劑,給藥1次。結(jié)果雌性小鼠的MTD>307.7或1003.5mg·kg-1,雄性小鼠>275.2或923.1mg·kg-1。實驗發(fā)現(xiàn)吸入rHLZ后無異常反應(yīng),所有兩組動物均存活到給藥后7d,在7d內(nèi)動物的活動、進(jìn)食、大便未見明顯異常,體重與同性別對照組比較無顯著性差異。4長期毒性試驗4.1大鼠單次給藥后安全指標(biāo)及評價試驗動物為Wistar大鼠,設(shè)低、中、高(1,5,25mg·kg-1·d-1)3個劑量組和溶劑對照組。給藥途徑為霧化吸入,bid,連續(xù)4周。觀測指標(biāo)有一般藥物反應(yīng)、尿液生化、外周血有形成分指標(biāo)、凝血指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、血清中大鼠抗rHLZ抗體、大體解剖、臟器重量及病理組織學(xué)檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥后對照組及各給藥組動物精神狀態(tài)良好,活動自如,大便成形,動物進(jìn)食量無明顯變化,各組動物體重不斷增加,對照組和各劑量之間體重增長無顯著差異(P>0.05)。各組動物尿液檢查未見異常。給藥組動物外周血指標(biāo)無異常變化。用藥組與溶劑對照組之間凝血酶原時間、凝血酶時間和活化部分凝血活酶時間無明顯變化。在給藥期和停藥期,對照組和給藥組動物血清總膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、血清鈣、血清磷、總蛋白、白蛋白、尿素氮和肌酐均在正常值范圍內(nèi)波動。各組動物大體解剖未見異常,給藥組與對照組之間動物臟器重量和臟器系數(shù)無明顯差異。給藥4周和停藥2周后,各劑量組與對照組相比均無與給藥相關(guān)的病理組織學(xué)改變。試驗結(jié)果表明,大鼠霧化吸入rHLZ1～25mg·kg-1·d-1,連續(xù)4周,無提示毒性反應(yīng)的指標(biāo)變化,故可以認(rèn)為≤25mg·kg-1·d-1為rHLZ在大鼠的安全劑量。在本試驗條件下未發(fā)現(xiàn)毒性靶器官。4.2動物癥狀及病理組織學(xué)檢測試驗動物為獼猴,設(shè)低、中、高(1,5,25mg·kg-1·d-1)3個劑量組和溶劑對照組。霧化吸入給藥,bid,連續(xù)4周。觀察指標(biāo)包括一般藥物反應(yīng)、尿液生化、心電圖、眼科檢查、凝血指標(biāo)、外周血有形成分各項指標(biāo)、血清生化指標(biāo)、血清中猴抗人溶菌酶抗體、大體解剖、臟器重量及病理組織學(xué)檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥后對照組及各給藥組動物精神狀態(tài)良好,活動自如,大便成形,動物食欲無明顯變化,對照組和各給藥組之間體重增長無顯著差異。給藥組動物的呼吸和鼻腔外觀等與溶劑對照組比較無明顯差別。各組動物尿液檢查未見異常。給藥組動物外周血指標(biāo)無異常變化。給藥組與溶劑對照組之間凝血酶原時間、凝血酶時間和活化部分凝血活酶時間無明顯變化。在給藥期和停藥期,對照組和給藥組動物血清總膽固醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、血清鈣、血清磷、總蛋白、白蛋白、尿素氮和肌酐均在正常值范圍內(nèi)波動。各組動物大體解剖未見異常,給藥組與對照組之間動物臟器重量和臟器系數(shù)無明顯差異。給藥4周和停藥2周后,各劑量組與對照組相比均無與給藥相關(guān)的病理組織學(xué)改變。獼猴霧化吸入rHLZ1～25mg·kg-1·d-1,連續(xù)4周,無提示毒性反應(yīng)的指標(biāo)變化,故可以認(rèn)為≤25mg·kg-1·d-1為rHLZ在獼猴的安全劑量。在本試驗條件下未發(fā)現(xiàn)毒性靶器官。5物環(huán)磷酰胺應(yīng)用效果選用昆明種種成年小白鼠,在妊娠后6～15d經(jīng)霧化吸入rHLZ低、中、高劑量(2,10,50mg·kg-1)及陽性藥物環(huán)磷酰胺8mg·kg-1(經(jīng)灌服)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),霧化吸入受試藥后,3個用藥組的孕鼠增重、胎盤重量、每窩胎鼠數(shù)、胎鼠骨化、皮膚出血點和出血斑、胎鼠的體重、身長、尾長、尾骨數(shù)等各項指標(biāo)與溶劑對照組比較無明顯差異。陽性藥環(huán)磷酰胺對母鼠有明顯的毒性,對胎鼠有致畸胎作用。結(jié)果表明rHLZ50mg·kg-1以下劑量對妊孕母鼠和胎鼠未見毒性作用,亦未見致畸胎性。6血清中猴抗人溶菌酶抗體檢測采用獼猴,試驗設(shè)低、中、高(1,5,25mg·kg-1·d-1)3個劑量組和溶劑對照組。霧化吸入給藥,bid,連續(xù)4周。觀察指標(biāo)為血清中猴抗人溶菌酶抗體。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥后,未能檢測到猴抗人溶菌酶抗體,表明rHLZ在獼猴無免疫原性。7病理組織學(xué)檢查采用獼猴,試驗設(shè)低、中、高(1,2,4mg·kg-1·d-1)3個劑量組和溶劑對照組共4個組。霧化吸入給藥,bid,連續(xù)1周。觀察指標(biāo)包括一般藥物反應(yīng)、鼻腔、氣管及肺的病理組織學(xué)檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn),給藥后給藥組和溶劑對照組動物精神狀態(tài)、食欲、大小便和體溫、體重等無異常變化。鼻腔和呼吸道等與試驗前比較無明顯變化。光鏡下,溶劑對照組和用藥組動物的氣管及肺組織結(jié)構(gòu)正常,細(xì)胞形態(tài)無異常,未見炎性細(xì)胞浸潤和水腫、充血、增生等病理改變。結(jié)果表明,霧化吸入rHLZ1,2,4mg·kg-1·d-1,連續(xù)7d,無呼吸道刺激性反應(yīng)。8動物藥代動力學(xué)研究8.1單次注射d7:1,3.采用ELISA免疫藥盒測定生物體液中rHLZ。給藥途徑為靜脈注射以及霧化吸入給藥。參照臨床應(yīng)用劑量按體表面積法折算為獼猴劑量。獼猴單次靜脈注射0.8,2.0和5.0mg·kg-1rHLZ后1min實測血清抗原濃度達(dá)到最高,各組平均濃度峰值Cmax分別為(767±305),(4633±3535)與(15219±7531)ng·mL-1,高劑量組與中、低劑量組相比P<0.05。低、中、高劑量注射后末端相半衰期t1/2分別為(6.5±0.5),(7.5±0.8)與(7.2±1.5)h,各組間無統(tǒng)計意義差別。AUC0～∞分別為(510±219),(1117±359)和(3964±1809)ng·h·mL-1。低劑量組與中、高劑量組比較P<0.05,中劑量組與高劑量組比較P<0.05。劑量之比為1:2.5:6.25,AUC0～∞的增長為1:2.2:7.8,全身清除率CLs不隨劑量增加而減慢。在注射劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)為線性藥動學(xué)。連續(xù)7d靜脈注射2.0mg·kg-1rHLZ后的血清抗原濃度-時間變化、藥動學(xué)參數(shù)和藥物體內(nèi)蓄積情況。結(jié)果表明,d7注射后各時間點的抗原濃度與首次注射后相同時間點濃度單側(cè)配對t檢驗無顯著差別。各藥動學(xué)參數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差別(P>0.05)。首次和第7次注射后注藥間隔(i)的AUC0-24h分別為(1108±359)和(1397±428)ng·h·mL-1(P=0.2106);蓄積因子(第7次AUC/第1次AUC)為(1.41±0.72)(P=0.1891)。結(jié)果提示注射rHLZ2.0mg·kg-1·d-1,連續(xù)注射7d后未觀察到具有統(tǒng)計學(xué)意義的抗原藥物的蓄積升高。此外還研究了霧化吸入rHLZ后的全身吸收情況以及生物利用度。將rHLZ配成20mg·mL-1的溶液,按照250μL·kg-1(相當(dāng)于5mg·kg-1)給動物霧化吸入后取血檢測rHLZ水平。結(jié)果表明,給藥后0.5,1,4,6,8h血清抗原濃度顯著高于給藥前水平,其他各時間點均在給藥前水平波動。AUC0～24h計算值為(2.0±3.5)ng·h·mL-1。與相同劑量靜脈注射給藥相比,霧化吸入局部給藥后相對生物利用度<1%,提示在上述給藥劑量下霧化吸入局部給藥全身吸收情況低,可以忽略不計。8.21u3000小鼠范圍125I-rHLZ結(jié)合凝膠高效液相色譜(SHPLC)和三氯醋酸(TCA)沉淀法研究了125I-rHLZ在小鼠體內(nèi)器官/組織中的濃度分布、代謝降解變化及其時間過程;總放射性在尿和糞中的排泄量和時間過程。在大鼠膽汁中的排泄量和時間過程,125I-rHLZ與血漿蛋白體外結(jié)合的情況。采用Iodogen法制備125I-rHLZ,SepgdexG-75分離純化標(biāo)記物。SHPLC鑒定125I-rHLZ的放射化學(xué)純度為98.5%,放射性比活度為23.7kBq·μg-1,蛋白質(zhì)濃度為0.5mg·mL-1,標(biāo)記前后溶菌酶活力相近。方法學(xué)確證表明125I-rHLZ結(jié)合SHPLC和TCA沉淀法測定生物樣品中125I-rHLZ的濃度滿足分布試驗要求。SHPLC測定表明小鼠靜脈注射125I-rHLZ后在機(jī)體內(nèi)迅速降解,靜脈注射后5min放射性主要為保留體積與標(biāo)準(zhǔn)125I-rHLZ相同的原形藥物,4h后放射性主要為保留體積增大的小分子125I標(biāo)記物。表明總放射性變化不能反映原形藥物濃度的變化。小鼠靜脈注射20μg·kg-1的125I-rHLZ后10min,4,8和24h,用TCA沉淀法測定全身組織的放射性,結(jié)果顯示AUC由高到低排列順序為:腎、頜下腺、腸內(nèi)糞、血清、膀胱、腸內(nèi)容、胸腺、肝、肺、小腸、脾、腎上腺、淋巴結(jié)、胰腺、生殖腺、脂肪、眼球、心臟、肌肉和腦。泌尿排泄系統(tǒng)濃度最高,除頜下腺濃度高于血清外,其他組織均低于血清,腦中濃度最低,藥物不易進(jìn)入血腦屏障。小鼠靜脈注射125I-rHLZ后放射性排泄較快,主要經(jīng)尿排泄,少量經(jīng)糞排泄。靜脈注射后24h尿和糞中排出放射性分別為注入量的(74.4±7.0)%和(3.7±0.8)%,96h尿糞總排出率為(81.4±7.0