幾種多酚化合物的抗氧化性評(píng)價(jià)

幾種多酚化合物的抗氧化性評(píng)價(jià)

在整個(gè)植物界，超過(guò)6500種酚類化合物或酚類化合物及其衍生物。這些化合物都是植物代謝過(guò)程中的次生副產(chǎn)物。它們存在于許多普通的水果、蔬菜中以及各種香辛料、谷物、豆類及果仁等中,是人們每天從飲食中攝取的數(shù)量最多的抗氧化物質(zhì)。多酚化合物具有酚羥基,能夠向脂質(zhì)過(guò)氧化自由基(LOO·)提供電子(氫),使之轉(zhuǎn)化成較穩(wěn)定的過(guò)氧化脂質(zhì)(LOOH),而多酚化合物自身則成為更加穩(wěn)定的酚氧自由基或其同系物。這些自由基遠(yuǎn)比脂質(zhì)過(guò)氧化自由基穩(wěn)定,從而打斷了自由基鏈反應(yīng)的進(jìn)行。故多酚化合物又可叫做自由基吸收劑。關(guān)于多酚化合物生理活性的研究是近年來(lái)多酚研究的熱點(diǎn)之一,也是多酚化學(xué)中發(fā)展最快的一個(gè)方向。多酚化合物的生理活性與多酚化合物具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化性能密切相關(guān)。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證明,很多疾病如組織器官老化等都與過(guò)剩的自由基有關(guān),因此多酚化合物通過(guò)清除自由基,能對(duì)自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)作用,維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性和蛋白質(zhì)的構(gòu)型構(gòu)象,防止輻射誘發(fā)的DNA斷裂。本實(shí)驗(yàn)利用多種不同的化學(xué)方法對(duì)幾種多酚化合物的抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià),并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行研究,以期為探討多酚化合物抗氧化、防衰老的保健功能提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1聚--環(huán)丙酸二銨鹽dmps茶多酚、槲皮素、芹菜素、山奈素、沒(méi)食子酸上海康九化工有限公司;VE北京索萊寶生物制品有限公司。α-脫氧核糖、二苯代苦味?；杂苫?DPPH·)、ABTS二銨鹽美國(guó)Sigma公司;鄰苯三酚、過(guò)硫酸鉀、過(guò)氧化氫、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、亞硫酸鐵、EDTA-Na2國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.2儀器722型分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司;恒溫水浴鍋余姚市東方電工儀器廠;UV-2401PC紫外分光光度計(jì)日本島津公司。1.3方法1.3.1多酚化合物對(duì)氧自由基h，o2-的去除能力的測(cè)定1.3.1.色漿中白砂糖的制備0.20mlFeSO4-EDTA混合液(10mmol/L)與0.20mlα-脫氧核糖溶液(10mmol/L)混合,然后加入一定量的樣品溶液,并用磷酸緩沖液(pH7.4,0.1mol/L)定容到1.8ml,最后加入0.20mlH2O2(10mmol/L),混勻后于37℃水浴中恒溫保持1h;然后再加入2.8%(W/W)三氯乙酸1.00ml,1.0%(W/W)硫代巴比妥酸1.00ml,混勻后于沸水浴中加熱10min;冷水冷卻后在532nm處測(cè)吸光度AS。不加樣品溶液,同上操作處理,測(cè)定其對(duì)比吸光度Ac。不加樣品溶液且不在37℃水浴中反應(yīng),其他處理同上,測(cè)定空白吸光度A0。則樣品的羥自由基清除能力可表示為;1.3.1.鄰苯三酚清除能力的測(cè)定,將a0和a0作為取4.5mlpH8.2、50mmol/LTris-HCl緩沖液,3.2ml蒸餾水,1ml樣品(空白管用蒸餾水代替)?；靹蚝笤?5℃水浴中保溫20min,取出后立即加入25℃預(yù)熱過(guò)的3mmol/L鄰苯三酚0.3ml(空白管用10mmol/LHCl代替)。迅速搖勻后倒入比色杯,325nm下每隔30s測(cè)吸光度,共測(cè)4min,推遲30s。樣品的O-2·清除能力可表示為:式中,A0為鄰苯三酚自氧化速率;A1為加入樣品后鄰苯三酚自氧化速率;A2為樣品的吸光度。1.3.2清除空白吸收劑a03.9ml、25mg/LDPPH甲醇溶液與0.1ml樣品甲醇溶液劇烈混合,暗處反應(yīng)30min(讀數(shù)較穩(wěn)定)后,515nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度,空白用甲醇代替樣品溶液。以清除率和樣品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,求IC50值。式中,A0為空白吸光度;A為樣品吸光度。1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備將7mmol/LABTS二銨鹽溶于水,與2.45mmol/L(終濃度)過(guò)硫酸鉀混合,混合液在室溫下放置12~16h,直至變成暗藍(lán)色。用乙醇稀釋此溶液,使在734nm處吸光度達(dá)到0.7。取該溶液1ml與10μl樣品溶液混合,在30℃分別于1、4、6min讀取吸光度。以清除率和樣品濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線,求IC50值。式中,A0為空白吸光度;A為樣品吸光度。1.3.4鐵氰化鉀混合鐵氰化鉀法1ml樣品溶液與2.5ml磷酸鹽緩沖液(0.2mol/L、pH6.6)及2.5ml1%鐵氰化鉀混合,50℃保溫20min,加入2.5ml10%三氯乙酸,混合,靜置10min。取2.5ml該液體,加等體積蒸餾水,混勻后加入0.5ml0.1%FeSO4,靜置10min后于700nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度。1.4不同評(píng)價(jià)方法的結(jié)果的相關(guān)分析采用SAS軟件,對(duì)各評(píng)價(jià)方法結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,p<0.05認(rèn)為顯著相關(guān)。2結(jié)果與分析2.1去除自由基o，o2的能力2.1.1多酚化合物對(duì)羥自由基的清除能力α-脫氧核糖法評(píng)價(jià)清除·OH能力的原理如下:·OH+α-脫氧核糖→氧化產(chǎn)物丙二醛丙二醛+TBA(TCA)→粉紅色化合物當(dāng)反應(yīng)體系中存在自由基清除劑時(shí),·OH被部分清除,丙二醛生成量減少,粉紅色化合物生成量減少,532nm下吸收減弱。不同多酚化合物清除羥自由基能力見(jiàn)表1。各個(gè)多酚化合物均對(duì)Fenton體系產(chǎn)生的·OH具有清除能力,清除能力大小順序?yàn)?茶多酚>槲皮素>沒(méi)食子酸>芹菜素>山奈素>VE,且隨多酚濃度增大,清除能力增強(qiáng)。茶多酚、槲皮素、沒(méi)食子酸的清除能力遠(yuǎn)大于芹菜素、山奈素和VE。其中,茶多酚為混合多酚、槲皮素為五酚、沒(méi)食子酸為三酚、芹菜素為三酚、山奈素為四酚、VE為單酚。除山奈素外,各物質(zhì)的酚羥基數(shù)越多,清除羥自由基能力越強(qiáng),有一定的構(gòu)-效關(guān)系趨勢(shì)。2.1.2清除超氧陰離子自由基能力的測(cè)定在堿性條件下(pH8.2),鄰苯三酚發(fā)生自氧化反應(yīng),生成超氧陰離子自由基(O2·)-和中間產(chǎn)物,該中間產(chǎn)物在325nm處有一特征吸收峰。當(dāng)加入自由基清除劑時(shí),O2·的-生成受到抑制,自氧化過(guò)程受阻,在325nm處的吸收減弱。不同多酚化合物清除超氧陰離子自由基能力見(jiàn)圖1、2。各個(gè)多酚化合物均對(duì)O2-·具有清除能力,清除能力大小順序?yàn)?茶多酚>槲皮素>沒(méi)食子酸>芹菜素>山奈素>VE,且隨濃度增大,清除能力增強(qiáng)。茶多酚、槲皮素的清除能力遠(yuǎn)大于其余各個(gè)酚類。這一結(jié)果,與多酚化合物清除羥自由基能力的結(jié)果是一致的,即除山奈素外,多酚的酚羥基數(shù)越多其清除能力越強(qiáng)。2.2清除dpph能力DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基,其結(jié)構(gòu)中含有1個(gè)帶孤對(duì)電子的氮原子,紫色,在515nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí),DPPH·的孤對(duì)電子被配對(duì)而使顏色變淺(黃色),最大吸收波長(zhǎng)處的吸收減弱。不同多酚化合物清除DPPH·能力見(jiàn)表2(以IC50值表示)。IC50值即清除50%自由基時(shí),所需要的多酚化合物濃度。故IC50值越小,多酚化合物清除自由基能力越強(qiáng)。多酚化合物清除DPPH·能力大小順序?yàn)?沒(méi)食子酸>槲皮素>茶多酚>山奈素>VE>芹菜素,且隨濃度增大,清除能力增強(qiáng)。尤其應(yīng)該注意的是,酚羥基數(shù)目多少與清除能力無(wú)關(guān)。2.3清除abts及dpph能力ABTS二銨鹽與過(guò)硫酸銨反應(yīng)生成藍(lán)綠色ABTS+·,在734nm處有強(qiáng)吸收。當(dāng)加入自由基清除劑時(shí),溶液顏色變淺,最大吸收波長(zhǎng)處的吸收減弱。不同多酚化合物清除ABTS+·能力見(jiàn)表3(以IC50值表示)。多酚化合物清除ABTS+·能力與清除DPPH·能力結(jié)果一致,為:沒(méi)食子酸>槲皮素>茶多酚>山奈素>VE>芹菜素,且隨濃度增大,清除能力增強(qiáng)。同樣,酚羥基數(shù)目多少與清除能力無(wú)關(guān)。綜上所述,在清除·OH和O2-·體系中,可能存在酚羥基數(shù)越多,清除能力越強(qiáng)的構(gòu)-效關(guān)系。但在清除DPPH·、ABTS+·體系中,這一結(jié)論是不成立的。2.4測(cè)定總吸光度lmf當(dāng)體系中存在還原性物質(zhì)時(shí),鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀,亞鐵氰化鉀在酸性條件下與三氯化鐵反應(yīng),生成普魯士藍(lán),在700nm處有最大吸收峰。故吸光度越大,反映多酚化合物還原能力越強(qiáng)。不同多酚化合物還原能力結(jié)果見(jiàn)表4。多酚化合物還原能力為:沒(méi)食子酸>槲皮素>茶多酚>VC>山奈素>VE>芹菜素。這一結(jié)果與多酚化合物清除DPPH·、ABTS+·能力大小一致,酚羥基數(shù)目多少與還原能力無(wú)關(guān)。另外,沒(méi)食子酸、槲皮素、茶多酚的還原能力,強(qiáng)于常用的還原劑VC。2.5抗氧化反應(yīng)的特性采用SAS軟件,對(duì)各化學(xué)評(píng)價(jià)方法結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析,分析結(jié)果見(jiàn)表5。還原能力法分析結(jié)果與DPPH·法、ABTS+·法分析結(jié)果,具有極顯著的正相關(guān)性(p<0.01);ABTS+·法分析結(jié)果與DPPH·法、α-脫氧核糖法分析結(jié)果,O2-·法分析結(jié)果與α-脫氧核糖法分析結(jié)果,具有顯-著的正相關(guān)性(p<0.05)。而還原能力法分析結(jié)果與α-脫氧核糖法、O2·法分析結(jié)果,DPPH·法分析結(jié)果與α-脫氧核糖法、O-2·法分析結(jié)果,ABTS+·法分析結(jié)果與O2-·法分析結(jié)果,不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的相關(guān)性(p>0.05)。抗氧化反應(yīng)的反應(yīng)機(jī)理可分為兩大類:(1)電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。即抗氧化劑通過(guò)轉(zhuǎn)移電子而使某些物質(zhì)(金屬、羰基、自由基)被還原。如還原能力法、DPPH·法、ABTS+·法。(2)氫原子轉(zhuǎn)移反應(yīng)。即抗氧化劑通過(guò)提供氫原子而清除某些自由基。如α-脫氧核糖法與O2-·法。相關(guān)性分析結(jié)果符合這一結(jié)論。采用SAS軟件對(duì)多酚化合物及四種清除自由基評(píng)價(jià)方法結(jié)果進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果見(jiàn)表6、7。模型的F值為31.54,p<0.0001,大于在0.01水平上的F值,故分析結(jié)果是可靠的。多酚化合物間差異的F值為6.7,p值為0.0018,大于在0.01水平上的F值,因此多酚化合物間存在有極顯著的差異,即沒(méi)食子酸、槲皮素、茶多酚的抗氧化能力相當(dāng),大于山奈素、VE、芹菜素的抗氧化能力。四種評(píng)價(jià)方法結(jié)果間差異的F值為72.93,p<0.0001,大于在0.01水平上的F值,因此評(píng)價(jià)方法結(jié)果間有極顯著的差異。即多酚化合物對(duì)ABTS+·的清除能力遠(yuǎn)強(qiáng)于對(duì)其他三種自由基的清除能力。3結(jié)論3.1酚羥基數(shù)目對(duì)清除dp的影響在清除·OH和O-2·的反應(yīng)體系中,除山奈素外,其余各物質(zhì)酚羥基數(shù)目越多,清除能力越強(qiáng)。在清除DPPH·和ABTS+·的反應(yīng)體系中,酚羥基數(shù)目多少與清除-能力無(wú)關(guān)。在評(píng)價(jià)還原能力時(shí),還原能力亦與酚羥基數(shù)目多少無(wú)關(guān)。因此,不能簡(jiǎn)單地得出酚羥基數(shù)目越多,化合物抗氧化能力越強(qiáng)的構(gòu)效關(guān)系。3.2未經(jīng)處理的酸、糊精素和茶多酚的抗逆性高于山奈素、ve和芹菜的抗逆性。多酚化合物對(duì)abt的去除能力比dpph-h、c和o2的移除能力強(qiáng)3.3還原能力法的結(jié)果表