考馬斯亮藍(lán)g-20顯色劑變色反應(yīng)的光譜法研究

考馬斯亮藍(lán)g-20顯色劑變色反應(yīng)的光譜法研究

蛋白質(zhì)是生物中最重要的生物因素，在生命活動過程中起著非常重要的作用。這是維持生命活動所必需的物質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)含量的測定對生物化學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)具有極其重要的意義。1976年，brd霍首次報道了用硅藍(lán)g-250（簡稱cmbg）測量微藻蛋白質(zhì)的方法。由于該方法具有高度靈活動用性、特異性強(qiáng)、操作簡單、干擾少等優(yōu)點(diǎn)，它已被廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)和臨床分析。雖然關(guān)于cbbg和生物厚碳蛋白質(zhì)相互作用的研究已報道，但其相互作用的機(jī)制尚未完全澄清。關(guān)于cbbg顯色劑本身的顏色反應(yīng)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究很少。我們的實(shí)驗(yàn)室對糖和光譜檢測的相互作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并提出了空間方向相互作用模型。這方面的這項研究工作為我們提供了一個完整的理論基礎(chǔ)，以便更好地闡明cbbg和生物厚碳蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)理，進(jìn)一步改進(jìn)和發(fā)展蛋白質(zhì)分析方法，闡明生物厚碳和光譜檢測相互作用的化學(xué)性質(zhì)。在這項工作中，我們使用光譜法研究了不同ph值下cmbg顯色劑的吸收光譜，并研究了不同實(shí)驗(yàn)條件下cmbg顯色劑吸收光譜的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，cbbg顯色劑呈現(xiàn)出五種顏色變化，如藍(lán)色、綠色和棕色，主要是由于cbbg分子之間的相互作用造成的。圖1顯示了康格的結(jié)構(gòu)方法。1實(shí)驗(yàn)1.1分光光度計U-3000分光光度計(日本Hitachi公司);UV-754分光光度計(上海精密科學(xué)儀器公司);PHS-P型酸度計(上海大中分析儀器廠).考馬斯亮藍(lán)G-250(CBBG),Fluka進(jìn)口分裝,上海試劑采購供應(yīng)站經(jīng)銷,其它試劑均為分析純或優(yōu)級純.1.2反應(yīng)試劑的制備因CBBG顯色劑對反應(yīng)體系酸度非常敏感,為了避免反應(yīng)體系受酸度的影響,在保證體系酸度恒定的條件下配制以下試劑.1.2.1l95%乙醇、磷酸溶液和酸鈉溶液將50mgCBBG溶解在25mL95%乙醇中,然后再加入85%磷酸50mL,用蒸餾水定容至500mL,貯存在棕色瓶中于4℃下避光保存.1.2.2不含磷酸cbbg顯色劑100mg/l的制備將25mgCBBG溶解在12.5mL95%乙醇中,用蒸餾水定容至250mL.1.2.3磷酸的bbg顯色劑的配制在已含有25mgCBBG,12.5mL95%乙醇的250mL容量瓶中,再加入40mL85%磷酸,用蒸餾水定容至250mL,即得含160mL/L磷酸的CBBG顯色劑,然后用不含磷酸的CBBG顯色劑按一定比例稀釋含160mL/L磷酸的CBBG顯色劑即可配制成不同磷酸濃度(20,40,60,80,100,120,140,160mL/L)的CBBG顯色劑(100mg/L).1.2.4不同濃度的cbbg顯色劑的配制將40mgCBBG溶解在5mL95%乙醇中,然后再加入85%磷酸10mL,用蒸餾水定容至100mL,即得濃度為400mg/L的CBBG顯色劑,然后用CBBG顯色劑按一定比例稀釋濃度為400mg/L的CBBG顯色劑即可配制成不同濃度(100,130,160,190,220mg/L)的CBBG顯色劑.1.2.5cbbg顯色劑的制備在已含有2mgCBBG,10mL95%乙醇的100mL容量瓶中,再加入10mL85%磷酸,用蒸餾水定容至100mL,即得含9.5%乙醇的CBBG顯色劑;在已含有2mgCBBG,90mL95%乙醇的100mL容量瓶中,加入10mL85%磷酸,即得含85.5%乙醇的CBBG顯色劑;然后將9.5%乙醇CBBG顯色劑和85.5%乙醇CBBG顯色劑分別按10∶0,9∶1,8∶2,6∶4,5∶5,4∶6,2∶8,1∶9,0∶10比例混合即可配制成不同乙醇濃度(9.5%,17.1%,24.7%,39.9%,47.0%,55.1%,70.3%,77.9%,85.5%)的CBBG顯色劑(20mg/L).1.2.6不同nacl濃度的cbbg顯色劑的配制在已含有10mgCBBG,5mL95%乙醇以及10mL85%磷酸的100mL容量瓶中,再加入溶解的14.610gNaCl水溶液,用蒸餾水定容至100mL,即得含2.50mol/LNaCl的CBBG顯色劑,然后用CBBG顯色劑按一定比例稀釋含2.50mol/LNaCl的CBBG顯色劑即可配制成不同NaCl濃度(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mol/L)的CBBG顯色劑(100mg/L).1.2.7hp--cd的配置在已含有10mgCBBG,5mL95%乙醇以及10mL85%磷酸的100mL容量瓶中,加入1.0g羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)水溶液,用蒸餾水定容至100mL,即得含有1.0%HP-β-CD的CBBG顯色劑,然后用CBBG顯色劑按一定比例稀釋含1.0%HP-β-CD的CBBG顯色劑即可配制成不同HP-β-CD濃度(0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%)的CBBG顯色劑(100mg/L).1.2.8tri能力顯色劑的配制在已含有10mgCBBG,5mL95%乙醇以及10mL85%磷酸的100mL容量瓶中,加入0.5mLTritonX-100即得含0.5%TritonX-100的CBBG顯色劑,然后用CBBG顯色劑按一定比例稀釋含0.5%TritonX-100的CBBG顯色劑即可配制成不同TritonX-100濃度(0.02%,0.04%,0.06%,0.08%,0.10%)的CBBG顯色劑(100mg/L).1.3掃描光譜和測定波長的確定在一系列12mm×100mm試管中,分別加入同一試劑不同濃度的CBBG顯色劑4mL,搖勻,5min后,以蒸餾水為參比掃描350~800nm間的吸收光譜或在給定波長下測量吸光度.2結(jié)果與討論2.1cbbg分子質(zhì)子化反應(yīng)進(jìn)程圖1為不同磷酸濃度下的CBBG顯色劑吸收光譜.從圖1可見隨著磷酸濃度的增大,595nm吸收峰逐漸紅移至650nm且不斷下降,465nm吸收峰逐漸升高.這種光譜變化對應(yīng)于CBBG顯色劑產(chǎn)生從藍(lán)色→綠色→棕紅色等多種顏色變化.CBBG分子中含有一個季胺、一個叔胺、一個仲胺和二個磺酸基團(tuán),在低磷酸濃度條件下,CBBG分子叔胺氮和仲胺氮不易發(fā)生質(zhì)子化,整個分子帶負(fù)電荷,由于體系的親水能力弱,CBBG分子間疏水作用力小于分子間斥力,分子不易聚集,為游離單體呈現(xiàn)藍(lán)色,最大吸收峰在595nm;隨著磷酸濃度的增大,叔胺氮逐漸發(fā)生質(zhì)子化(叔胺氮pKb為5.15,仲胺氮pKb為0.79),CBBG分子呈現(xiàn)電中性,由于反應(yīng)體系的親水能力不斷增強(qiáng),對CBBG分子的疏水作用力逐漸增加,CBBG分子的芳環(huán)結(jié)構(gòu)通過疏水相互作用相互聚集,形成了聚集體.此時,CBBG顯色劑游離單體和聚集體共存,表現(xiàn)為綠色,最大吸收峰在650nm;隨著磷酸濃度的進(jìn)一步增大,仲胺氮也相繼發(fā)生質(zhì)子化,CBBG轉(zhuǎn)變成完全質(zhì)子化形式,整個分子帶正電荷.此時反應(yīng)體系的親水能力增強(qiáng),對CBBG分子疏水作用力進(jìn)一步增加,使CBBG分子間的疏水相互作用增強(qiáng),CBBG分子間疏水作用力大于分子間斥力,CBBG分子的芳環(huán)結(jié)構(gòu)通過疏水相互作用相互聚集程度進(jìn)一步增大,全部形成了CBBG聚集體,CBBG顯色劑呈現(xiàn)為棕紅色,最大吸收峰在465nm.從現(xiàn)象上看,隨著磷酸濃度的增大,反應(yīng)體系產(chǎn)生了從藍(lán)色→綠色→棕紅色等多種顏色變化.當(dāng)磷酸濃度超過100mL/L時,反應(yīng)體系靜置12h后產(chǎn)生了聚集體沉淀.因此,我們認(rèn)為CBBG顯色劑隨著磷酸濃度逐漸增大呈現(xiàn)出從藍(lán)色→綠色→棕紅色等多種顏色變化是在CBBG發(fā)生質(zhì)子化的基礎(chǔ)上,主要由疏水相互作用形成的聚集體聚集程度不同而引起的.CBBG的顏色變化與反應(yīng)體系的酸度變化有關(guān),Compton和Jones認(rèn)為CBBG在顯色液中存在三種形式即陰離子形式B、中性形式G和陽離子形式R.CBBG的解離平衡式如下:CBBG分子在pH1.25的體系中不發(fā)生質(zhì)子化反應(yīng),為未質(zhì)子化的陰離子形式B,呈現(xiàn)藍(lán)色,其最大吸收峰在595nm,如圖2a所示;CBBG中性分子G為單個胺基質(zhì)子化形式,體系呈現(xiàn)綠色,其最大吸收峰在650nm;CBBG分子在pH0.30的體系中發(fā)生完全質(zhì)子化,為完全質(zhì)子化的陽離子形式R,呈現(xiàn)棕紅色,其最大吸收峰在465nm,如圖2b.Compton和Jones認(rèn)為CBBG顯色劑的顏色變化主要是由單體質(zhì)子化引起的.2.2反應(yīng)體系的綠色逐漸加深,聚集體的形成圖3為固定磷酸濃度100mL/L(pH0.53),改變CBBG的濃度而繪制的吸收光譜.從圖3可見,在不同CBBG濃度的反應(yīng)體系中,隨著CBBG濃度的逐漸增大,465nm和595nm吸收峰不斷升高,但以650nm吸收峰升高的幅度最大(與465nm吸收峰升高的幅度相比較).從現(xiàn)象上看,反應(yīng)體系的綠色逐漸加深,當(dāng)CBBG濃度超過130mg/L以上時,反應(yīng)體系在靜置12h后會形成綠色的聚集體沉淀.這說明在磷酸濃度100mL/L的條件下,CBBG以游離單體和聚集體形式共存,隨著CBBG濃度的逐漸增大,CBBG游離單體和聚集體也相應(yīng)增多,但以聚集體增加顯著,導(dǎo)致反應(yīng)體系的綠色逐漸加深和聚集體沉淀的形成.在反應(yīng)體系磷酸濃度不變的條件下,僅依靠單體質(zhì)子化是很難解釋綠色聚集體的形成.2.3不含磷酸的cbbg顯色劑的顏色變化規(guī)律從圖4可以看出,含磷酸的CBBG顯色劑在乙醇濃度低于24.7%范圍時,最大吸收波長650nm不變.但隨著乙醇濃度的增加,最大吸收波長發(fā)生藍(lán)移,當(dāng)藍(lán)移至最大吸收波長612nm時又恒定不變,且與不含磷酸的CBBG顯色劑的最大吸收波長在612nm處重合.在中性條件下,CBBG在不含磷酸CBBG顯色劑溶液中最大吸收波長隨著乙醇濃度的增加逐漸紅移,當(dāng)乙醇濃度增加至39.9%以上時,最大吸收波長紅移至612nm時保持不變,這可能是在中性條件下不含磷酸的體系CBBG聚集體逐漸解體成單體CBBG分子的緣故.在酸性條件下,由于隨著乙醇濃度的增大,含磷酸的CBBG顯色劑溶液中CBBG分子間的疏水相互作用逐漸被破壞,CBBG聚集體逐漸解體,當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70.3%時,全部解體變?yōu)閱误wCBBG分子.此時,含磷酸的CBBG顯色劑和不含磷酸的CBBG顯色劑最大吸收波長在612nm處發(fā)生重合,表明此時含磷酸的CBBG顯色劑中聚集體已全部解體變?yōu)镃BBG單體分子.在反應(yīng)體系磷酸濃度恒定不變的條件下,含磷酸的CBBG顯色劑也產(chǎn)生了由棕紅色→綠色→深藍(lán)色等多種顏色變化,這充分說明了CBBG顯色劑產(chǎn)生的顏色變化主要是由疏水相互作用形成聚集體聚集程度不同所引起的.2.4顯色劑的力量從圖5可見,隨著NaCl濃度的增加,595nm的吸光值不斷下降,465nm的吸光值不斷升高,導(dǎo)致CBBG顯色劑棕紅色逐漸變深.這是由于隨著NaCl濃度的增加,反應(yīng)體系的親水能力增強(qiáng),對CBBG分子的疏水作用力增加,使CBBG分子間的疏水相互作用增強(qiáng),聚集程度不斷加大,形成了CBBG聚集體,故而CBBG顯色劑棕紅色逐漸變深.這種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與反應(yīng)體系中增加磷酸濃度產(chǎn)生的現(xiàn)象完全一致,說明CBBG分子間疏水作用力在形成聚集體過程中起主要作用.2.5hp--cd包合反應(yīng)體系的結(jié)構(gòu)從圖6可以看出,隨著HP-β-CD濃度的增大,595nm的吸光值逐漸增加,465nm的吸光值逐漸下降,導(dǎo)致CBBG顯色劑由棕色變?yōu)榫G色.HP-β-CD分子具有較大的疏水空腔,與芳香族化合物進(jìn)行包結(jié)反應(yīng),能破壞CBBG分子間的疏水相互作用.隨著HP-β-CD濃度的增加,CBBG分子間疏水相互作用逐漸遭到破壞,部分聚集體解體變?yōu)閱误w.由于低濃度的HP-β-CD破壞CBBG分子間的疏水相互作用能力較弱,不能將所有的聚集體轉(zhuǎn)變?yōu)閱误w,因此反應(yīng)體系中聚集體和單體共存,CBBG顯色劑只能變?yōu)榫G色,不能完全轉(zhuǎn)變?yōu)镃BBG單體所特有的深藍(lán)色.2.6顯色劑的顏色轉(zhuǎn)變圖7可見,隨著TritonX-100濃度的增大,595nm的吸光值逐漸升高,465nm的吸光值逐漸降低,導(dǎo)致CBBG顯色劑產(chǎn)生了顏色變化,由棕色→綠色→深藍(lán)色.TritonX-100為非離子表面活性劑,破壞疏水相互作用能力強(qiáng).由于TritonX-100濃度的增大,CBBG分子間的疏水相互作用逐漸遭到破壞,CBBG聚