桔皮中橙皮甙的分離及抑菌試驗(yàn)

桔皮中橙皮甙的分離及抑菌試驗(yàn)

柑橘是我國(guó)廣泛種植的主要水果。它的皮膚可以用作中藥，具有理氣、健脾、除濕、粘液等的功效。橙皮甙是桔皮的主要活性成分之一,具有治療高血壓、血管硬化及心血管等疾病的功效。據(jù)報(bào)道,桔皮提取浸膏有較好的抗菌作用,在室溫下儲(chǔ)存一段時(shí)間后仍有一定的抗菌能力。目前,從生物材料中提取天然防腐劑已成為當(dāng)今世界食品添加劑的一大趨勢(shì)。為了探明桔皮提取浸膏中抑菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)以橙皮甙為材料,對(duì)常見(jiàn)食品污染菌的抑菌效果進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1試劑與培養(yǎng)基細(xì)菌:金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Echerichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis);酵母:漢遜氏酵母(Hansenulasp);霉菌:青霉(Penicilliumsp)、黑曲霉(Aspergillussp)。分別簡(jiǎn)寫為S、E、B、H、P和A,以上菌種由湖北農(nóng)學(xué)院生命科學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。牛肉膏、蛋白胨、瓊脂為生化級(jí)試劑;蔗糖(A.R級(jí))、NaCl(A.R級(jí))、甲醇(A.R級(jí))、HCl(A.R級(jí))、NaOH(A.R級(jí))。以上試劑由湖北省化學(xué)試劑公司供貨。柱層析硅膠(粒徑0.05～0.074mm)、硅膠GF254,均為青島海洋化工有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。橙皮甙化學(xué)對(duì)照品,由中國(guó)藥品生物制品檢定所生產(chǎn)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基按文獻(xiàn)自制。儀器有FTIR-1730型紅外光譜儀,CJ-1680型超凈工作臺(tái),YSQ.SG41.280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋,HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋,YS2-H型雙目生物顯微鏡,LRH250G型光照培養(yǎng)箱,JA2003型電子天平,ZK-072型恒溫干燥箱。1.2紅外光譜表征取干桔皮粉30g,10%的氯化鈣15mL,5%的偏重亞硫酸鈉10mL,10%的氫氧化鈉15mL,飽和的氫氧化鈣600mL置容器內(nèi)。水浴加熱至50℃保溫3h,過(guò)濾后濾液用稀鹽酸調(diào)pH至6～7,冷卻放置過(guò)夜,抽濾所得的固體物反復(fù)用熱水洗至淡黃色。將固體物溶于吡啶的甲醇溶液(含吡啶1%)中,以柱層析硅膠為固定相,甲醇為洗脫液,得白色針狀晶體。測(cè)定熔點(diǎn)為256～258℃。經(jīng)紅外光譜儀測(cè)定(KBr壓片),其特征吸收峰為:3545cm-1(s、O-H),2945cm-1(w、C-H),1636cm-1(m,C=C),1602cm-1(s、C-O),1100cm-1、1073cm-1(s、C-O-C)。熔點(diǎn)及紅外表征數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值相符。將所得的產(chǎn)物溶于甲醇,以硅膠GF254為固定相,甲醇為展開(kāi)劑,薄層層析只觀察到一個(gè)點(diǎn),Rf值為0.87,其結(jié)果與用橙皮甙標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。1.3無(wú)菌試驗(yàn)1.3.1生物指標(biāo)及培養(yǎng)條件將培養(yǎng)基制成平板,細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基,酵母及霉菌用PDA培養(yǎng)基。用無(wú)菌生理鹽水把各種菌種配制成106～107個(gè)/L孢子懸液,吸取0.2mL孢子懸液均勻涂抹到滅菌平板上。將浸漬過(guò)橙皮甙溶液的濾紙圓片(φ6cm)風(fēng)干,放到每個(gè)涂有菌液的平板上,等距離放3片,每個(gè)試驗(yàn)平行6次,文中所列數(shù)據(jù)為平均值。細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24h;酵母及霉菌在28℃下培養(yǎng)48h。測(cè)定抑菌圈直徑大小,并用無(wú)菌水作空白對(duì)照(以CK表示),確定抑菌效果。以上操作均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。1.3.2以數(shù)為基礎(chǔ)的社會(huì)量表用無(wú)菌甲醇將橙皮甙配制成7種質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液,各溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.06%、0.08%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%。將濾紙片置于各質(zhì)量分?jǐn)?shù)的溶液中浸泡,涼干,放入平板中,測(cè)定不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)橙皮溶液的抑菌效果。1.3.3ph對(duì)牛肉膏蛋白和pda培養(yǎng)基的制備用Na2HPO4和NaH2PO4配制5個(gè)pH梯度的緩沖溶液,pH分別為5、6、7、8、9。并用各種pH緩沖溶液制備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基。將濾紙片置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%橙皮甙溶液中浸泡、涼干,放入平板中,測(cè)定其抑菌效果。1.3.4抑菌效果測(cè)定將橙皮甙置80℃水浴,100℃水浴和121℃濕熱條件下,熱處理15min后,將在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%橙皮甙溶液浸泡過(guò)濾紙片,涼干后置于平板中,測(cè)定其抑菌效果。2結(jié)果與分析2.1生物指標(biāo)對(duì)甲基霉菌及漢遜氏酵母生長(zhǎng)的影響橙皮甙對(duì)試驗(yàn)的6種菌的生長(zhǎng)均有很強(qiáng)的抑制作用,其中對(duì)酵母菌的抑制作用最強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí),橙皮甙對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、青霉及黑曲霉的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng);當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%時(shí),橙皮甙對(duì)金黃色葡萄球菌和漢遜氏酵母的生長(zhǎng)抑制作用最強(qiáng)?？瞻讟訜o(wú)抑菌作用,見(jiàn)表1。2.2橙皮蚤對(duì)6種病原菌生長(zhǎng)的影響除金黃色葡萄球菌、枯草桿菌及大腸桿菌在pH=5時(shí)不能生長(zhǎng)外,在pH5～9范圍內(nèi),橙皮甙對(duì)6種菌的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用,見(jiàn)表2。2.3高溫處理對(duì)橙皮茯苓的抑菌力橙皮甙經(jīng)3種溫度處理15min后,仍具有很強(qiáng)的抑菌力,與未經(jīng)高溫處理的樣品對(duì)比,兩者實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)明顯變化,說(shuō)明高