細(xì)菌胞外產(chǎn)物體外抑菌活性研究

細(xì)菌胞外產(chǎn)物體外抑菌活性研究

這些物質(zhì)富含氨基酸。在加工和貯藏過(guò)程中，微生物易于生長(zhǎng)和繁殖，最終導(dǎo)致腐敗和變質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球有近25%的包括水產(chǎn)品在內(nèi)的食品因微生物而導(dǎo)致污染。目前控制微生物污染主要采用化學(xué)方法和物理方法，化學(xué)方法是在食品中加入防腐劑等化學(xué)物質(zhì)，物理方法則主要是對(duì)食品進(jìn)行超高壓、電離輻射、臭氧等處理，這2種方法不同程度上容易引起二次污染、降低食品品質(zhì)等問(wèn)題，因此開(kāi)發(fā)相對(duì)安全的微生物控制技術(shù)和手段已成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)又稱(chēng)為芽孢乳酸菌，是一類(lèi)認(rèn)為“普遍安全的”桿菌類(lèi)乳酸菌，對(duì)人體無(wú)害，且不改變食品自身的特性，具有較好的應(yīng)用前景。研究表明，乳酸菌能夠產(chǎn)生大量的抑菌物質(zhì)如酸、過(guò)氧化氫、細(xì)菌素等，具有可抑制腐敗菌和致病菌生長(zhǎng)的能力，進(jìn)而對(duì)包括水產(chǎn)品在內(nèi)的食品等起到防腐保鮮的效果。凝結(jié)芽孢桿菌同樣可以產(chǎn)生乳酸、凝結(jié)素等物質(zhì)。鑒于此，本研究通過(guò)采用牛津杯法，體外研究凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物的抑菌特性，旨在為后續(xù)的應(yīng)用研究和水產(chǎn)品防腐保鮮劑開(kāi)發(fā)奠定一定的基礎(chǔ)。1材料和方法1.1腐敗菌的檢測(cè)凝結(jié)芽孢桿菌LL1103：本實(shí)驗(yàn)室分離篩選自養(yǎng)殖大黃魚(yú)，并保藏備用；選取大腸桿菌(Ecoli)、腐敗希瓦氏菌(Shewanellaspp.)、銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)等為腐敗菌。胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、過(guò)氧化氫酶：美國(guó)Sigma公司；營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。1.2方法1.2.1最佳抑菌ph值的確定不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)胞外產(chǎn)物抑菌效果的影響研究：間隔12測(cè)定抑菌圈直徑，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間。初始培養(yǎng)基pH值對(duì)抑菌效果的影響研究：按照6%的接種量將凝結(jié)芽孢桿菌接種到pH值分別為2～10的培養(yǎng)基中，通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑確定最佳抑菌pH值。初始培養(yǎng)溫度對(duì)抑菌效果的影響研究：同樣按照6%的接種量將凝結(jié)芽孢桿菌接種后，在溫度分別為0、4、10、20、30、37、40、50℃的條件下培養(yǎng)，通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑確定最佳培養(yǎng)溫度。1.2.2活性物質(zhì)的提取在不同處理?xiàng)l件(溫度、pH、酶)下，研究凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物對(duì)常見(jiàn)腐敗菌的抑制效果。一定濃度凝結(jié)芽孢桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)(150r/min)48h后，離心(8000g,10min)取上清液為胞外產(chǎn)物備用。通過(guò)測(cè)定抑菌圈直徑，研究不同溫度(60、80、100、121℃處理15min)和pH值(2.0～10.0)對(duì)胞外產(chǎn)物抑菌效果的影響。此外，在胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、過(guò)氧化氫酶的最適pH值(分別為2.0、7.4、7.4、7.3)條件下，胞外產(chǎn)物與酶37℃反應(yīng)1h，隨后在沸水中處理5min以使酶失活，再調(diào)至初始pH值，研究不同酶處理對(duì)胞外產(chǎn)物抑菌效果的影響。1.2.3培養(yǎng)基抑菌圈直徑測(cè)定大腸桿菌、腐敗希瓦氏菌、銅綠假單胞菌等分別制成約1×107cfu/mL的菌懸液備用，吸取200μL不同菌懸液到營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻，倒置培養(yǎng)1后安放牛津杯，每個(gè)培養(yǎng)皿放置2個(gè)。在培養(yǎng)皿中加入凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物200μL，分別在最適溫度下恒溫培養(yǎng)24h，測(cè)定抑菌圈直徑。每組均設(shè)定3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0單因子方差Duncan法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。2結(jié)果與分析2.1初始培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物抑菌效果的影響由圖1可見(jiàn)，不同培養(yǎng)時(shí)間凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物的抑菌效果不同。培養(yǎng)前6h，抑菌效果較差，主要原因可能是該階段凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)緩慢，尚沒(méi)有足夠的胞外產(chǎn)物。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，胞外產(chǎn)物對(duì)腐敗菌的抑菌效果顯著增強(qiáng)，究其原因可能是凝結(jié)芽孢桿菌開(kāi)始大量生長(zhǎng)，導(dǎo)致具有抑菌性的代謝產(chǎn)物和酸性物質(zhì)的積累。培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48h以后，胞外產(chǎn)物的抑菌效果不再隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增強(qiáng)。分析可能原因是該菌自身的生長(zhǎng)也受到了培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)等的限制，部分菌體衰亡，因此胞外產(chǎn)物中的抑菌物質(zhì)濃度不再積累。圖2顯示了不同初始pH值對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物抑菌性能的影響。初始pH值為6.0時(shí)該菌胞外產(chǎn)物對(duì)腐敗菌的抑菌效果最佳，結(jié)果表明凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物的抑菌效果受到初始pH值的顯著影響。究其原因可能有以下2個(gè)方面，一是初始pH值的不同直接影響了凝結(jié)芽孢桿菌自身的生長(zhǎng)；二是影響了胞外產(chǎn)物的分泌。不同培養(yǎng)溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物抑菌效果的影響參見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，初始培養(yǎng)溫度為37℃時(shí)，抑菌效果最佳。溫度為50℃時(shí)，該菌的胞外產(chǎn)物基本上沒(méi)有抑菌性能。原因可能同樣與凝結(jié)芽孢桿菌的生長(zhǎng)情況有關(guān)。2.2發(fā)酵溫度對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物的抑菌性影響表1結(jié)果顯示，凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物經(jīng)不同溫度處理后抑菌活性與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，這表明凝結(jié)芽孢桿菌產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物對(duì)熱穩(wěn)定。不同pH值處理后胞外產(chǎn)物表現(xiàn)出不同程度的抑菌性能，其中pH4～7時(shí)，pH值越小抑菌性越強(qiáng)，但是差異不顯著(P>0.05)；當(dāng)pH2時(shí)，胞外產(chǎn)物的抑菌效果顯著下降(P<0.05)；而pH8時(shí)，胞外產(chǎn)物仍表現(xiàn)出一定的抑菌性，但是當(dāng)pH10時(shí)，沒(méi)有抑菌效果。研究結(jié)果表明，從抑菌效果評(píng)價(jià)，凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物對(duì)低pH值和高pH值均不穩(wěn)定。由圖4結(jié)果可見(jiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物經(jīng)過(guò)氧化氫處理以后，抑菌性出現(xiàn)一定程度的下降，但是與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，殘留的抑菌性均達(dá)到88%以上。這表明凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物中含有過(guò)氧化氫物質(zhì)，且該物質(zhì)對(duì)指示菌起到一定的抑制效果，但并不是主要的抑菌物質(zhì)。胞外產(chǎn)物經(jīng)過(guò)不同酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K)處理以后，其對(duì)指示菌表現(xiàn)出不同程度的抑制效果。根據(jù)圖4結(jié)果顯示，經(jīng)胃蛋白酶處理以后，胞外產(chǎn)物的抑菌性與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明其對(duì)胃蛋白酶不敏感。而經(jīng)胰蛋白酶和蛋白酶K處理以后，抑菌活性與對(duì)照組相比發(fā)生明顯下降(P<0.05)，凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物抑菌作用僅剩50%，這說(shuō)明胞外產(chǎn)物中存在的某些物質(zhì)被這2種酶降解。3凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物對(duì)水產(chǎn)品保鮮中革蘭陰性腐敗菌的抑制作用本研究以分離自養(yǎng)殖大黃魚(yú)的凝結(jié)芽孢桿菌為研究對(duì)象，結(jié)果表明，其胞外產(chǎn)物能夠有效地抑制水產(chǎn)品中主要腐敗菌的生長(zhǎng)，因此具有成為水產(chǎn)品防腐保鮮劑的潛在價(jià)值。通過(guò)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物的最佳培養(yǎng)條件研究發(fā)現(xiàn)：當(dāng)初始培養(yǎng)溫度為37℃、pH6.0、培養(yǎng)時(shí)間達(dá)到48h時(shí)，對(duì)腐敗菌的抑制效果達(dá)到最佳；對(duì)該菌的生長(zhǎng)特性研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)生長(zhǎng)條件要求比較簡(jiǎn)單，在較短時(shí)間產(chǎn)生的胞外產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抑菌性，適合于規(guī)?；囵B(yǎng)與應(yīng)用，該菌的生長(zhǎng)特性研究結(jié)果與前期Hyronimus、Abada、Riazi和Garcia等研究結(jié)果具有一定的一致性。目前隨著生物保鮮劑的應(yīng)用，乳酸菌由于能產(chǎn)生抑菌物質(zhì)細(xì)菌素如Nisin已逐漸成為研究熱點(diǎn)。但是Nisin以及其他一些生物保鮮劑存在的主要缺點(diǎn)是抑菌譜較窄，對(duì)革蘭陰性菌沒(méi)有顯著的抑菌效果，所以只能局限于某些特定的食品中，而對(duì)以革蘭陰性腐敗菌為主要腐敗菌的水產(chǎn)品保鮮則不能達(dá)到很好的保鮮效果。本實(shí)驗(yàn)研究凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物能夠有效地抑制水產(chǎn)品中革蘭陰性腐敗菌的生長(zhǎng)，具有較好的應(yīng)用潛力。其次，大量研究表明，乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素在堿性條件下不能起到抑制腐敗菌的生長(zhǎng)，這大大地限制了其在水產(chǎn)品中的應(yīng)用，因?yàn)槟壳坝醒芯勘砻?，水產(chǎn)品在整個(gè)保鮮過(guò)程中其pH處于偏中性條件，后期處于弱堿性條件，而在這種條件下，乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素?zé)o法對(duì)腐敗菌起到很好的抑制效果，限制了其在水產(chǎn)品中的應(yīng)用。而本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌胞外產(chǎn)物的研究，表明了其在偏中性和弱堿性條件下仍能對(duì)腐敗菌起到較好的抑制效果