轉(zhuǎn)b基因抗蟲玉米的研究

轉(zhuǎn)b基因抗蟲玉米的研究

棉花是重要的棉花害蟲。自20世紀80年代末以來，棉蟲已成為中國夏玉米的主要害蟲，遼寧省南部的春玉米在穗期通常會減少5%7%，嚴重病例可能會減少超過10%。棉鈴蟲的危害常誘發(fā)玉米穗腐病的發(fā)生,造成更為嚴重的損失。棉鈴蟲危害玉米主要發(fā)生在玉米的穗期,即抽雄散粉后,由于這時玉米植株高大,傳統(tǒng)的防治方法操作困難。1996年在美國開始商業(yè)化種植以歐洲玉米螟Ostrinianubilalis(Hübner)為靶標害蟲的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米(以下簡稱Bt玉米),為鱗翅目害蟲的防治開辟了新的途徑。大量研究結(jié)果表明,Bt玉米對靶標害蟲歐洲玉米螟有很好的控制效果,而對非靶標的鱗翅目其它玉米害蟲,如玉米穗蛾Helicoverpazea(Boddie)、秋粘蟲Spodopterafrugiperda(Smith)和西南玉米螟DiatraeagrandiosellaDyar的控制效果因Bt基因的不同而異[11,12,13,14,15,16],Bt玉米植株體內(nèi)Bt殺蟲毒蛋白的表達存在時空差異,因而對害蟲的控制作用表現(xiàn)出時間和空間上的動態(tài)變化[10,11,12,13,14,15,16]。國外Bt玉米對我國玉米上的主要害蟲亞洲玉米螟O.furnacalis(Guenue7b0e)具有很好的防治效果,對粘蟲Mythimnaseparata(Walker)和甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner也有很好的殺蟲效果,但Bt玉米對棉鈴蟲的控制效果尚未見報道。作者研究了轉(zhuǎn)Btcry1Ab基因玉米雌穗不同組織對棉鈴蟲幼蟲存活、生長發(fā)育和繁殖的影響及田間抗蟲效果,旨在明確轉(zhuǎn)cry1Ab基因Bt玉米對棉鈴蟲的殺蟲活性與控制效果,為今后組建以Bt玉米為基礎(chǔ)的主要害蟲綜合防治技術(shù)體系提供科學依據(jù)。1材料和方法1.1對照品種孟山都遠東有限公司本研究所用的供試轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲玉米YieldGard?(MON810)及其非轉(zhuǎn)基因?qū)φ掌贩N由孟山都遠東有限公司提供。供試Bt玉米及其對照品種種植在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所試驗田,每小區(qū)30m2(6m×5m),行距60cm,株距25cm,試驗重復3次,試驗小區(qū)隨機區(qū)組排列,生長期不使用任何農(nóng)藥,常規(guī)管理。1.2試驗昆蟲試驗所用棉鈴蟲由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所棉花害蟲研究組提供,為室內(nèi)人工飼料繁殖,初孵幼蟲均為孵化后不超過24h的幼蟲。1.3內(nèi)部測量1.3.1幼蟲感染試驗在玉米抽絲時,將整個雌穗帶回實驗室,留下里面3層幼嫩的苞葉,消毒處理后剪成2.0cm×3.0cm的小塊,放入塑料測試盒(Φ3cm×5cm)中,每盒放2~3片,接棉鈴蟲初孵幼蟲1頭,然后置于26±1℃、80%RH、光照周期14L∶10D養(yǎng)蟲室中。每1或2天調(diào)查1次,記錄存活幼蟲數(shù),并根據(jù)組織被取食消耗情況隨時添加或更換相同來源的新組織,直至幼蟲全部死亡或化蛹。每處理100頭幼蟲,重復3次。1.3.2玉米材料的消毒處理在玉米抽絲期,將雌穗采回,剪掉露在苞葉外的花絲,選用未露出玉米苞葉的花絲,消毒處理后,盤成環(huán)狀,放入測試盒中,每盒放入3~5根花絲,接初孵幼蟲1頭。處理步驟和重復次數(shù)同苞葉。1.3.3清卵粒的制備在籽粒灌漿后期,從田間采回經(jīng)人工授粉的玉米雌穗,剝?nèi)グ~后用無菌處理的刀將籽粒單粒連同穗軸一起切下,呈牙齒形,選取完整未破損的籽粒放入測試盒中,每盒1~2粒,接初孵幼蟲1頭。處理步驟和重復次數(shù)同苞葉。1.4利用袋的方式防止天敵的影響在玉米穗期花絲抽出不久,用小號毛筆將棉鈴蟲初孵幼蟲直接接到花絲上,每株接5頭,然后套袋以避免捕食性天敵的影響,標明接蟲日期。每處理接3~10行,每行10~30株,視蟲源多少決定接蟲量,要保證在所有對照區(qū)內(nèi)造成可以觀測到的嚴重損害。在接蟲1~2周后,逐株調(diào)查植株被害程度,記錄每株幼蟲存活數(shù)和穗軸被害長度,作為判斷YieldGard?抗蟲標準。1.5統(tǒng)計分析方法采用SAS程序PROCTTEST進行統(tǒng)計分析,百分數(shù)首先進行反正弦轉(zhuǎn)換。2結(jié)果與分析2.1不同地域?qū)γ掴徬x初孵和10d不同發(fā)育的影響取食Bt玉米花絲的棉鈴蟲初孵幼蟲5天的死亡率達到53.0%,13天達到89.0%,雖然極少數(shù)個體可存活23天,但發(fā)育受到嚴重抑制,在3齡以下全部死亡。而以非轉(zhuǎn)Bt基因玉米花絲飼養(yǎng)的棉鈴蟲初孵幼蟲5天和13天的死亡率分別為14.0%和38.3%,與取食Bt玉米的棉鈴蟲差異極顯著(P<0.01),并且12天開始有幼蟲化蛹,23天化蛹率達到98.0%,有51.0%的幼蟲完成世代發(fā)育(圖1)。取食Bt玉米幼嫩籽粒和穗軸的棉鈴蟲初孵幼蟲5天的死亡率為90.0%,11天達到98.0%,雖然極少數(shù)個體可存活22天,但發(fā)育受到嚴重抑制,在3齡以下全部死亡。而以非轉(zhuǎn)Bt基因玉米幼嫩雌穗飼養(yǎng)的棉鈴蟲初孵幼蟲5天和11天的死亡率分別為46.0%和59.0%,與Bt玉米差異極顯著(P<0.01),并且11天開始有幼蟲化蛹,19天存活幼蟲全部化蛹,有22.0%的幼蟲完成世代發(fā)育(圖2)。以Bt玉米苞葉飼養(yǎng)棉鈴蟲初孵幼蟲,5天后幼蟲全部死亡,而非Bt玉米對照平均僅為16.0%,存在顯著差異(P<0.001)(圖3)。2.2成蟲危害及訴訟情況田間玉米花絲期人工接棉鈴蟲抗性鑒定結(jié)果表明,Bt玉米雌穗被害率為3.5%,危害級別為0.007±0.005,百株存活幼蟲14.3頭,均在3齡以下。而非Bt玉米雌穗被害率達到82.5%,危害級別為2.51±0.27,平均百株存活幼蟲79.6頭,顯著高于Bt玉米(t株率=8.07,df=8,P=0.0001;t級別=10.49,df=98,P=0.0001;t活蟲數(shù)=8.57,df=98,P=0.0001)。結(jié)果說明Bt玉米穗期對棉鈴蟲的防治效果非常明顯(表1)。3對棉鈴蟲的抗蟲性測定Bt玉米的重要特性之一是靶標害蟲明確、殺蟲譜專一性強。但田間實際往往是一種作物在其生長過程中常受到多種害蟲的危害。如在美國,除歐洲玉米螟嚴重危害玉米外,玉米穗蛾、秋粘蟲和西南玉米螟等都是玉米上的重要害蟲。在我國,除亞洲玉米螟是玉米上的第一大害蟲外,許多鱗翅目害蟲如棉鈴蟲等常年危害玉米。YieldGard?Bt玉米的靶標害蟲是歐洲玉米螟,植株體內(nèi)表達Cry1Ab蛋白,其葉片的平均蛋白表達量為9.35μg·g-1鮮重,全株為3.65~4.65μg·g-1鮮重,表明其全生育期都能高劑量地表達殺蟲蛋白,對于歐洲玉米螟的田間防治效果達96%以上,對非靶標害蟲如玉米穗蛾、秋粘蟲和西南玉米螟的防治效果亦達93%以上。本研究室內(nèi)和田間結(jié)果均表明,YieldGard?Bt玉米對棉鈴蟲具有很高的抗蟲性。與化學農(nóng)藥防治害蟲時采用殺死較大齡期幼蟲的方法不同,Bt玉米是通過害蟲的初孵幼蟲取食表達具有殺蟲作用的殺蟲蛋白植物組織,從而將害蟲殺死在低齡狀態(tài)。因此,評價轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲性首先必須明確害蟲最初取食的作物組織器官的殺蟲效果。棉鈴蟲主要發(fā)生在穗期,初孵幼蟲主要危害新鮮花絲,其次是苞葉、幼嫩籽粒和穗軸等,YieldGard?花絲和苞葉中的Cry1Ab殺蟲蛋白的含量分別為1527.45ng·g-1和1219.38ng·g-1,僅次于心葉組織,而幼嫩雌穗尖和籽粒中殺蟲蛋白的含量分別為830.68ng·g-1和652.25ng·g-1,比花絲和苞葉低。本研究結(jié)果表明,取食孟山都轉(zhuǎn)Btcry1Ab基因玉米YieldGard?的花絲、籽粒、穗軸及苞葉等重要組織部位的棉鈴蟲初孵幼蟲不能存活,田間亦顯著地降低了對玉米的危害,即對棉鈴蟲具有較高的殺蟲活性和田間防治效果。但同時亦顯示,取食Bt玉米花絲和幼嫩籽粒及穗軸的幼蟲存活時間比苞葉的長,說明Bt玉米不同組織器官的殺蟲活性有差異,殺蟲效果與殺蟲蛋白的含量并不完全一致,與Bt