峰山海泥浸液體外殺菌蠕形螨的實(shí)驗(yàn)研究

峰山海泥浸液體外殺菌蠕形螨的實(shí)驗(yàn)研究

蠕蟲是一種高度感染率的寄生蟲。有兩種寄生蟲可以寄生蟲在人體，尤其是血脂蟲虱（dap）和毛發(fā)蟲虱（df）。蠕形螨可阻塞毛囊并可機(jī)械性和化學(xué)性雙重刺激損害人體皮脂和毛囊腺,引起人體蠕形螨病。感染者局部可有輕微瘙癢感或燒灼刺痛,主要表現(xiàn)為鼻尖和鼻翼兩側(cè)皮膚彌漫性潮紅、充血、紅色丘疹、膿皰、結(jié)痂和脫屑,可引起痤瘡、酒糟鼻、毛囊炎、臉緣炎和眼瞼炎等一系列皮膚疾患,嚴(yán)重地影響患者的容貌。常用于治療蠕形螨病的藥物主要有甲硝唑、伊維菌素、硫磺乳、復(fù)合維生素B和中藥制劑等,但效果均不理想。趙亞娥等對二甲基亞砜(DMSO)體外殺螨效果進(jìn)行研究,結(jié)果表明40%為DMSO最低有效濃度,其殺螨能力強(qiáng)于10%和5%的硫磺乳,但DMSO具有極強(qiáng)的吸濕性,不易保存,且高濃度的DMSO對生物細(xì)胞有一定的毒性。民間早有用礦物泥治療腳癬和真菌感染等皮膚病的應(yīng)用實(shí)例,且效果較好。研究表明,熱泥可使所敷部位溫度增高,增強(qiáng)血液循環(huán)和淋巴循環(huán),使局部皮膚組織代謝能力加強(qiáng),汗腺分泌增加,末梢血管擴(kuò)張,促進(jìn)泥中元素、有機(jī)物和藥物吸收等作用,泥對組織可產(chǎn)生壓迫、松弛和疏通氣血作用,并可去除皮膚表面的病理脫皮、生理陳皮,有利于新皮的生成。有些泥中含有磁場元素,其磁作用可改變某些生物特性,調(diào)節(jié)生物磁場,秀山海泥富含豐富的抗氧化活性營養(yǎng)成分。但有關(guān)礦物泥殺螨作用的研究,迄今鮮有報(bào)道。本文對秀山海泥浸液體外殺螨進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)觀察,并與臨床常用的中藥類殺螨制劑10%硫磺乳進(jìn)行對比,以期為秀山海泥的應(yīng)用提供理論依據(jù)。材料和方法1取藝術(shù)昆蟲來源1.1主要試劑和儀器秀山海泥采自浙江省岱山縣秀山灘涂。10%硫磺乳(批號為20100237)購自湖南省常德武陵制藥廠。數(shù)碼顯微鏡(MoticDMB5型)為廈門麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品;pH計(jì)(DELTA320型)為瑞士梅特勒-托利多公司產(chǎn)品。1.2螨蟲來源隨機(jī)抽取浙江海洋學(xué)院在校學(xué)生為取螨對象,刮片式取螨器由有機(jī)玻璃制成,為6cm×3cm×0.5cm,表面打磨光滑,取螨端厚度稍薄但不銳利。將取螨器與額頭處皮膚成70°左右,由左向右刮取8cm,用潔凈的牙簽從取螨器上將分泌物刮到載玻片上,加1～2滴甘油,鏡下分離兩種人體蠕形螨并計(jì)數(shù),每份標(biāo)本含運(yùn)動(dòng)活潑的蠕形螨30條以上,有15條以上而不足30條者以兩次合計(jì)結(jié)果為1次合格標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。2體外殺病效果測定2.1海泥浸液的制備從秀山灘涂的起始位置,按高、中和低潮位各取1點(diǎn),合并3點(diǎn)的泥樣樣品。將海泥加蒸餾水?dāng)嚢?過篩(800目),離心后收集濕泥,干燥粉碎過篩(800目),得海泥干粉(含水量<5%)。取200g海泥干粉,加400ml蒸餾水,攪拌均勻,靜置過夜,取上清150ml,經(jīng)65℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至15ml,制得濃度為5kg/L的秀山海泥濃縮浸液。用蒸餾水將海泥濃縮浸液稀釋為2.5、2.0、1.5、1和0.5kg/L等5個(gè)濃度,備用。于20℃,70%濕度下測定秀山海泥稀釋液及原液的pH值,每個(gè)樣品平行測定3次。2.2體外殺滅實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組分別加上述5個(gè)濃度的秀山海泥稀釋液200μl于涂有兩種蠕形螨的載玻片上,均勻鋪開,保證與蟲體充分接觸;陽性對照組加10%硫磺乳乳濁液200μl,空白對照組加200μl生理鹽水;各組實(shí)驗(yàn)需同時(shí)進(jìn)行。分別于5min、10min、20min、40min、1h、2h、4h、8h、12h和24h觀察記錄蟲體死亡情況,并計(jì)算秀山海泥浸液體外殺螨率,鏡下觀察蠕形螨的活動(dòng)度和形態(tài)。2.3蟲體死亡與活動(dòng)度的判斷(-):蟲體螯肢或足爪持續(xù)1min不動(dòng)者,初定為死亡;間隔30min后繼續(xù)觀察,仍不動(dòng)者為死亡;(+):活動(dòng)遲緩,1～2只足爪/螯肢活動(dòng),且1min活動(dòng)1～2次;(++):活動(dòng)明顯,3～5只足爪/螯肢活動(dòng),且1min活動(dòng)3～5次;(+++):活動(dòng)活躍,6只以上足爪/螯肢活動(dòng),且1min活動(dòng)6次以上?；顒?dòng)加劇持續(xù)時(shí)間從加藥開始計(jì)時(shí),至蟲體恢復(fù)加藥前狀態(tài)為止。由于蠕形螨活動(dòng)加劇持續(xù)時(shí)間的差異較大,為避免極大值和極小值的影響,本研究選取可避免極端數(shù)據(jù)的中位數(shù)來客觀的反映蠕形螨的活動(dòng)加劇持續(xù)時(shí)間。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,組間分析采用配對樣本t檢驗(yàn),半致死濃度(LC50)值由Probit模塊進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果1海泥浸液滲出物測定1.1皮脂蠕形螨鏡下觀察,加入秀山海泥浸液前,皮脂蠕形螨體壁光滑,活動(dòng)度多為+～++。加入浸液后可見蟲體皺縮變形、扭動(dòng)。足體與末體相交處套疊、蟲體變短、皮紋清楚。加入濃度為2.5kg/L海泥浸液時(shí),蟲體四對足爪運(yùn)動(dòng)加快,活動(dòng)度呈+/++～+++的蟲體達(dá)79.4%(27/34),活動(dòng)加劇持續(xù)時(shí)間為15min,之后部分蟲體體壁出現(xiàn)滲出物,尤以足體處滲出明顯,隨著秀山海泥浸液作用時(shí)間的延長,滲出物逐漸增多,蟲體活動(dòng)度變化減弱,最終死亡,說明2.5kg/L的海泥浸液能在短時(shí)間內(nèi)迅速引起蟲體的強(qiáng)烈變化并致其死亡;當(dāng)海泥浸液濃度遞減至1.0kg/L時(shí),活動(dòng)度為+/++～+++占68.9%(26/38),但活動(dòng)加劇持續(xù)時(shí)間則延長至100min,之后蟲體活動(dòng)開始漸漸減弱,最終死亡;當(dāng)海泥浸液濃度低至0.5kg/L時(shí),活動(dòng)度呈+/++～+++的蟲體僅為32.5%(13/40),活動(dòng)度并沒有明顯的上升,說明0.5kg/L的海泥浸液對皮脂蠕形螨的活動(dòng)度和形態(tài)并沒有明顯影響(表1、圖1)。2體外殺病效果2.1皮脂蠕形螨經(jīng)測定不同濃度海泥浸液的pH值符合人體皮膚的最佳pH值范圍(4.5～6.6)。海泥浸液濃度為2.5kg/L時(shí),2h即可殺死全部螨蟲,與空白、陽性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),隨著濃度的降低,皮脂蠕形螨死亡時(shí)間逐漸延長,當(dāng)濃度降至2.0kg/L和1.5kg/L時(shí),皮脂蠕形螨全部死亡的時(shí)間分別延長至4h和8h,仍優(yōu)于空白與陽性對照組(P<0.05)。濃度降至1.0kg/L時(shí),8h殺螨率僅為47.4%,但仍高于空白對照組和陽性對照組(P<0.05)。當(dāng)濃度低至0.5kg/L時(shí),殺螨率明顯降低,與空白對照組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),低于陽性對照組(P<0.05)。由此可見,1.0kg/L的秀山海泥濃縮浸液是體外殺滅皮脂蠕形螨的最低有效濃度。LC50(1h)=1913mg/L。秀山海泥浸液對皮脂蠕形螨的體外殺滅作用濃度和時(shí)間呈正比(表3)。2.2毛囊蠕形螨秀山海泥浸液濃度為2.5kg/L時(shí),2h即可殺死全部螨蟲,與空白、陽性對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),當(dāng)濃度下降至2.0kg/L、1.5kg/L時(shí),毛囊蠕形螨全部死亡時(shí)間均延長至8h,相同時(shí)間內(nèi)殺滅效果優(yōu)于空白、陽性對照組(P<0.05),當(dāng)濃度稀釋至1.0kg/L時(shí),24h殺螨率下降至38.5%,但仍優(yōu)于空白對照組(P<0.05),與陽性對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。濃度稀釋至0.5kg/L時(shí),24h殺螨率與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),低于陽性對照組(P<0.05)。說明1.0kg/L的秀山海泥濃縮浸液是體外殺滅皮脂蠕形螨的最低有效濃度。LC50(1h)=2131mg/L,秀山海泥浸液對皮脂蠕形螨的體外殺滅作用濃度和時(shí)間呈正比(表4)。海泥浸液的殺初步結(jié)果人體蠕形螨呈世界性分布,對人體皮膚的危害不容忽視。尤其它所引發(fā)的皮膚病,可破壞面部容貌。國外學(xué)者報(bào)道人群感染率為27%～100%,國內(nèi)人群感染率一般在20%以上,最高可達(dá)97.8%,目前臨床上抗蠕形螨治療尚缺乏安全、高效的理想藥物。傳統(tǒng)殺螨劑,如臨床常用的10%硫磺乳,雖除螨效果較好,但長期使用硫磺制劑對皮膚刺激性較大,會引起皮膚干燥脫屑等不良反應(yīng)。國內(nèi)學(xué)者也嘗試研制對人體皮膚刺激較小的中藥類除螨劑,如趙亞娥等報(bào)道了樟腦精油可作為天然高效的殺螨藥物,其殺螨機(jī)制推測主要作用于螨蟲的神經(jīng)肌肉系統(tǒng),引起蟲體劇烈的痙攣收縮后松弛死亡。李朝品研究了百特藥液等對蠕形螨的殺滅作用,顯示此類中藥抑制劑對蠕形螨具有一定的抑殺效果。這些中藥抑制劑雖然具有一定的殺螨作用,但由于中藥材的篩選,有效成分的提取等方面存在一定的困難,未能有效推廣利用。秀山海泥浸液的殺螨率與海泥浸液濃度和蟲種有關(guān),濃度為2.5kg/L時(shí),皮脂蠕形螨和毛囊蠕形螨全部死亡時(shí)間均為2h。濃度降至2.0kg/L時(shí),皮脂蠕形螨的全部死亡時(shí)間為4h,而毛囊蠕形螨則延長至8h。當(dāng)濃度降至1.0kg/L時(shí),8h內(nèi)對皮脂蠕形螨與毛囊蠕形螨的殺滅率分別為47.4%和15.4%,更低的濃度則無明顯殺滅效果?？梢娦闵胶Ｄ嘟簩ζぶ湫悟臍缱饔寐詮?qiáng)于毛囊蠕形螨。海泥作為一種新興的美容保健產(chǎn)品,含有豐富的礦物質(zhì)、膠體成分、海洋特有的微生物及維生素、氨基酸和抗菌素等,具有獨(dú)特的美容、保健和治療功效。在中國連池和以色列死海等地區(qū),用來美化肌膚,理療皮膚而開發(fā)制成的礦物質(zhì)泥產(chǎn)品,受到人們的歡迎,但目前多用于護(hù)膚產(chǎn)品,用于殺螨的較少。秀山海泥浸液與傳統(tǒng)的西藥殺螨劑相比,其pH值在人體皮膚的最佳pH值范圍,不會破壞皮膚表面的弱酸環(huán)境,從而避免對皮膚造成損害,與中藥類除螨劑相比,又具有資源量大,工藝簡便的特性,為未來的臨床應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。目前有關(guān)殺螨作用機(jī)理方面的研究國內(nèi)外報(bào)道很少,梁沛等報(bào)道了殺螨劑主要作用于螨類的神經(jīng)系統(tǒng),刺激神經(jīng)膜上的離子通道,抑制膽堿激性和單胺激性神經(jīng)系統(tǒng)的酶;或作用于呼吸系統(tǒng),抑制三羧酸循環(huán)過程中的酶,或解偶聯(lián)氧化磷酸化,阻斷電子傳遞;或阻止幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)合成;或影響螨的生長及生殖。也可能抑制螨的正常代謝,干擾RNA的合成,因此下一步將對秀山海泥的具體殺螨機(jī)制進(jìn)行研究。1.2毛囊蠕形螨加入秀山海泥浸液后,毛囊蠕形螨的四對足和尾部開始呈現(xiàn)頻率較快的伸縮運(yùn)動(dòng),四對足不停的滑動(dòng),身體左右擺動(dòng),運(yùn)動(dòng)一定距離(3～6mm)后出現(xiàn)皺縮變形,足體中央消化管開始收縮,隨著秀山海泥浸液作用時(shí)間的延長,部分蟲體最后解體。在濃度為2.5kg/L的浸液中,蟲體變化較皮脂蠕形螨有所減弱,25min左右才活動(dòng)加劇,隨著作用時(shí)間的延長,活動(dòng)度為+/++～+++的蟲體占65.7%(23/35)。經(jīng)過20min的活動(dòng)加劇時(shí)間之后,蟲體活動(dòng)漸漸減弱,變?yōu)槲⑷踝慊顒?dòng),