廣西紅樹林土壤放線菌多樣性的初步研究

廣西紅樹林土壤放線菌多樣性的初步研究

紅樹林是熱帶海岸地帶獨特的植物群落，具有巨大的生物多樣性。放線菌不僅能產(chǎn)生多種抗生素,同時也可產(chǎn)生多種具有抗腫瘤活性的物質(zhì)。而紅樹林下的土壤底泥對微生物來說是一個特殊的生存環(huán)境,此生境中放線菌資源的多樣性具有非常重要的研究價值。我國南部邊陲潮間帶的海岸紅樹林主要分布于廣西、廣東、海南、臺灣、福建和浙江南部沿岸。其中,廣西紅樹林資源最為豐富,其資源量居全國第2位,廣西合浦的山口、東興的北侖河、防城港的新地和北海的大冠沙等紅樹林自然保護區(qū)內(nèi)放線菌資源也十分豐富。筆者對廣西紅樹林土壤放線菌的多樣性進行了初步研究。采用溶菌酶、蛋白酶K消化破壁、酚-氯仿抽提的方法,有效提取了放線菌基因組DNA,所獲得的DNA可直接作為模板用于16SrDNA的擴增鑒定。1材料和方法1.1材料表面1.1.1紅樹林的海污泥樣本廣西合浦山口海泥樣本32份、東興北侖河海泥樣本13份、防城港新地海泥樣本10份、北海大冠沙海泥樣本20份。1.1.2khpo比例的確定培養(yǎng)基組成:可溶性淀粉2.0%、KNO30.1%、K2HPO40.05%、MgSO40.05%、FeSO40.001%、重鉻酸鉀0.01%,用過濾海水1000ml配制,調(diào)節(jié)其pH值為7.2～7.4。1.1.3主要試劑瓊脂糖,氯仿,異戊醇,乙醇,λDNAHindⅢ等。1.1.4這些機器恒溫水浴鍋,離心機,振蕩儀,電泳儀,PCR儀等。1.2方法1.2.1放線菌從紅樹林土壤中分離1.2.1.土壤懸液的測定稱取土壤5g,放入45ml盛無菌海水的三角燒瓶中,振蕩10min,得稀釋10倍的土壤懸液。另取盛有9ml無菌海水的試管4支,取稀釋10倍的土壤懸液1ml加入試管中,使之充分混勻,即得10-2土壤稀釋液;采用同樣的方法依次得到10-3、10-4、10-5土壤稀釋液。1.2.1.培養(yǎng)基的制備吸取土壤稀釋液各1ml放入培養(yǎng)皿中。將熔化保溫50℃左右含有0.01%重鉻酸鉀的高氏1號培養(yǎng)基分別倒入上述培養(yǎng)皿中,輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿,使菌液和培養(yǎng)基混勻鋪平,凝固后倒置于28～30℃恒溫箱中培養(yǎng)6～7d。將形態(tài)較典型的放線菌菌落挑出,經(jīng)過2～3次平板劃線分離純化后轉(zhuǎn)種到高氏1號斜面培養(yǎng)基中保存,編號后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.2放線菌重組瘤的dna提取1.2.2.兩組菌體生長情況的比較將分離的放線菌轉(zhuǎn)接到高氏1號液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～7d,取生長良好的放線菌菌液2ml置于EP管中,10000r/min離心8min,棄上清,保留菌體。1.2.2.樣品總總提取方法①破壁、蛋白質(zhì)和核酸分離:每個EP管加入TE溶液300μl,用槍頭吹吸3次充分混勻,10000r/min離心5min,棄上清液,再加入20mg/ml的溶菌酶溶液15μl,用槍頭充分混勻,37℃水浴4h;每個EP管中加入20mg/ml蛋白酶K溶液8μl,再加入10%SDS溶液和0.5mol/L的EDTA溶液各40μl,輕搖,55℃水浴過夜。②抽提:加等體積的Tris飽和酚,顛倒使之充分混勻,10000r/min離心8min,取上清轉(zhuǎn)至另1支新的1.5mlEP管中,再加等體積24∶1的氯仿/異戊醇,充分混勻,10000r/min離心8min,取上清轉(zhuǎn)至另1支1.5mlEP管中。③沉淀:加等體積異丙醇,-20℃沉淀30min,8000r/min離心5min,棄上清保留沉淀。④洗滌:加70%乙醇洗滌沉淀2次,每次洗滌后8000r/min離心5min,棄上清保留沉淀DNA。⑤洗脫:將EP管倒置于濾紙上,充分干燥后加TE溶液20μl,室溫放置15min,4℃過夜使DNA充分溶解。1.2.2.3.輻射誘導(dǎo)組的dna提取效果取5μl基因組DNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳(電壓80V)進行檢測,260nm紫外燈下觀察電泳結(jié)果。1.2.3引物設(shè)計與pcr擴增將得到的放線菌基因組DNA進行16SrDNA擴增(PCR反應(yīng)采用大連寶生物公司提供的ExTaq試劑盒),取所提DNA各500ng作為模板,10×ExTaqbuffer(Mg2+Plus)5.0μl,dNTPMixture(各2.5mmol/L)4.0μl,設(shè)計其16SrDNA特異性引物如下:引物A:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;引物B:5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′,引物(上海生工提供,0.02nmol/L)各1μl,TakaraExTaq(5U/μl)1.0μl,最終補足反應(yīng)體系至50μl。PCR擴增條件為:94℃預(yù)變性5min,95℃變性1min,65℃退火1min,72℃延伸3min,共30個循環(huán),最后72℃延伸10min。取部分PCR擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,其余擴增產(chǎn)物于-20℃條件下保存。2結(jié)果與分析2.1放線菌重組瘤的dna提取結(jié)果選取6株生物學(xué)特性比較典型的菌株提取DNA,所得DNA電泳后在19Kb以上位置出現(xiàn)明顯的DNA條帶區(qū)(圖1)。2.21pcr擴增dna以所提基因組DNA為模板進行PCR擴增,可有效擴增出16SrDNA基因(圖2)。電泳后目的條帶特異性較強、產(chǎn)量較大,說明所提DNA完全可用作PCR反應(yīng)的模板,而且DNA中不含酶促反應(yīng)的抑制物。PCR產(chǎn)物純化后送上海生工進行測序,成功獲得了放線菌樣本的序列。3海洋生物活性物質(zhì)是放線菌的重要來源目前,實驗室提取細菌DNA的方法主要有以下幾類:高溫加熱法、堿裂解法、SDS裂解法及超聲裂解法等,這些方法往往只能提取革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌中的一類,缺乏通用性,步驟繁瑣、費時、效率低。該研究建立了一種簡便的紅樹林放線菌基因組DNA的提取方法,得到的基因組DNA具有較好的完整性,無需純化即可用于16SrDNAPCR擴增等分子生物學(xué)操作,為鑒定放線菌奠定了基礎(chǔ)。紅樹林是自然分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落,海岸潮間帶是海洋和陸地的過渡帶,具有不同于陸地的性質(zhì):水分和鹽分高、氧氣缺乏,地下微生物與其他生態(tài)系統(tǒng)地下微生物具有很大差異。研究表明,紅樹林根系放線菌的種類和數(shù)量,均較菜園、湖畔、海泥等地放線菌豐富。有效獲得放線菌基因組DNA是對其進行分類鑒定的前提,可為研究放線菌代謝產(chǎn)物和篩選新的生物活性物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。目前,抗藥性微生物數(shù)量不斷增加,急需尋找新的抗生素來源物種。而從陸地放線菌中很難發(fā)現(xiàn)和篩選到生物活性物質(zhì)。據(jù)不完全統(tǒng)計,到目前為止,由放線菌產(chǎn)生的抗生素已達4000種以上。從海洋中尋找新的放線菌物種是目前放線菌研究的一個新方向。目前,陸地微生物藥物的篩選率逐漸降低,而占地球表面積70%的