鎖陽(yáng)藥材hplc指紋圖譜和有效成分含量測(cè)定

鎖陽(yáng)藥材hplc指紋圖譜和有效成分含量測(cè)定

cykorrizan是cykorrizan科的一種寄生植物。它通常生長(zhǎng)在位于栽培植物白刺（nidaribircam）的干燥部位。主要生長(zhǎng)于干燥和堿性沙地。主要產(chǎn)于內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、青海等西北地區(qū)。鎖陽(yáng)味甘、性溫,具有補(bǔ)腎、助陽(yáng)、益精、潤(rùn)腸養(yǎng)筋之效用,中醫(yī)用于治療陽(yáng)痿、遺精、不孕、腰膝酸軟、腸燥便秘等。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明:鎖陽(yáng)具有提高機(jī)體免疫力、清除自由基、抑制人體免疫缺陷病毒(HIV)、抑制血小板聚集和雌激素樣等多種藥理活性。鎖陽(yáng)中的化學(xué)成分主要有有機(jī)酸、黃酮類、酚類、甾體類、三萜類、鞣質(zhì)、糖苷等多種成分,其中黃酮類成分具有提高機(jī)體免疫力、清除自由基的活性。近年來(lái),指紋圖譜技術(shù)已被許多國(guó)家和國(guó)際組織用于天然產(chǎn)物的質(zhì)量控制,尤其是HPLC指紋圖譜,已廣泛用于中藥的鑒別和質(zhì)量控制,并取得重要的進(jìn)展。本文利用HPLC建立鎖陽(yáng)指紋圖譜,并建立同時(shí)測(cè)定鎖陽(yáng)中有效成分兒茶素、根皮苷的方法,為鎖陽(yáng)質(zhì)量控制和有效利用提供參考。1儀器、試劑和材料1.1高效液相色譜儀儀:dz體調(diào)溫?zé)犭娞?as-ap18-一種RE-52C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鞏義市英峪予華儀器廠);SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠);BS224S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);DZTW型調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器廠);Agilent1200高效液相色譜儀(AgilentTechnologies,USA),包括G1312ABinarypump,aG1315BDAD,G1328BManualinjector,Autosampler,AgilentChemstationsoftware;ODS-APC18(250mm×4.6mm,i.d.,5μm;大連依利特分析儀器有限公司)。1.2標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)劑:siga兒茶素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,批號(hào):877-200001),根皮苷對(duì)照品(美國(guó)Sigma公司,批號(hào):083K7072);乙腈為色譜純(山東禹王實(shí)業(yè)集團(tuán)禹城化工廠),其它試劑均為分析純,純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。鎖陽(yáng)樣品由中科院蘭州化物所戚歡陽(yáng)副研究員鑒定為鎖陽(yáng)科植物鎖陽(yáng)CynomoriumsongaricumRupr.的肉質(zhì)莖(樣品信息見表1)。2方法和結(jié)果2.1樣品溶液和對(duì)照溶液的制備2.1.1超聲-濾渣法將鎖陽(yáng)樣品粉碎,過(guò)40目篩,準(zhǔn)確稱取2g,置于具塞三角瓶中,加入15ml甲醇,在溫度為40℃,頻率為50kHz條件下超聲30min后,抽濾。濾渣再同法提取2次,合并3次濾液,濃縮至近干,加入甲醇溶解轉(zhuǎn)移定容至5ml容量瓶中,備用。臨用前取上清液,經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。2.1.2%/ml和0.“ml”溶液精密稱取兒茶素和根皮苷對(duì)照品適量,分別用甲醇溶解定容到容量瓶中,配成濃度分別為0.6020mg/ml和0.1936mg/ml溶液。分別精密量取上述溶液各1ml,置5ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到濃度分別為0.1204mg/ml(兒茶素)和0.0387mg/ml(根皮苷)的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液,備用。2.2流動(dòng)相-乙腈相法色譜柱為ODS-APC18(250mm×4.6mm,i.d.,5μm;大連依利特分析儀器有限公司);流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B),梯度洗脫:0～20min,10%～40%(A),20～60min,40%(A);流速1.0ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)280nm,柱溫為室溫,進(jìn)樣體積20μl,自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。2.3鎖陽(yáng)指紋圖譜的建立對(duì)上述條件下的液相色譜指紋圖譜分析比較和對(duì)已知化合物的確認(rèn),并將色譜信息通過(guò)相似度軟件計(jì)算,從10個(gè)樣品的色譜信息中獲取共有峰,建立鎖陽(yáng)指紋圖譜,見圖1。共有峰的相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積見表2～3。2.4重復(fù)性和線性范圍取1#樣品溶液,連續(xù)進(jìn)樣5次,測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和峰面積的RSD值均小于5%。其中:兒茶素和根皮苷的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值分別為0.18%和0.32%(n=5),相對(duì)峰面積的RSD值分別為0.97%和2.18%,表明精密度良好。取1號(hào)樣品6份,分別精密稱定,按照“2.1”項(xiàng)方法制備樣品溶液,利用“2.3”項(xiàng)建立的色譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)得每份樣品中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD值均小于5%。其中:兒茶素和根皮苷的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值分別為1.42%和2.16%(n=5),相對(duì)峰面積的RSD值分別為1.94%和2.95%,表明其重復(fù)性較好。2.4.4線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和線性范圍分別精密量取等量的兒茶素、根皮苷對(duì)照品溶液,均勻混合后,用自動(dòng)進(jìn)樣器分別吸取對(duì)照品溶液1,2,5,10,15,20μl,利用“2.3”項(xiàng)建立的色譜條件進(jìn)樣分析。以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,分別得到兒茶素和根皮苷的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和線性范圍:Y=70.992X-31.927,r=0.9996,0.1024～3.612μg(n=3);Y=91.91X-8.7264,r=0.9998,0.0387～1.1616μg(n=3)。2.5加樣回收率測(cè)定總成分配比的確定精密稱取適量已知含量的鎖陽(yáng)樣品6份,分別加入適量?jī)翰杷睾透ぼ盏膶?duì)照品,按照“2.1”項(xiàng)方法制備樣品溶液,利用“2.3”項(xiàng)建立的色譜條件進(jìn)樣分析,測(cè)定兒茶素和根皮苷的平均回收率分別為100.5%(RSD=1.87%),99.3%(RSD=2.54%)。結(jié)果見表4。3討論3.1樣品預(yù)處理和色度條件的優(yōu)化3.1.1提取條件的篩選分別考察了50%甲醇、甲醇和乙醇3種提取溶劑。經(jīng)考察發(fā)現(xiàn)50%甲醇、乙醇作為提取溶劑時(shí),提取物中成分復(fù)雜,干擾兒茶素與根皮苷的分離。甲醇作為提取溶劑既能提取所需要的成分,又能減少大量其它物質(zhì)的干擾,所以選擇甲醇作為提取溶液。以甲醇為提取溶劑,分別考察了回流提取法、超聲提取法、索氏提取法對(duì)提取的影響。研究表明:在溫度為40℃,功率為50kHz的超聲提取條件下含量最高,并且操作簡(jiǎn)單方便。在此基礎(chǔ)上利用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了最佳提取條件,正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知:所得最佳提取條件為2g藥材超聲提取3次,每次加入15ml甲醇,每次提取30min。3.1.2流動(dòng)相及色譜波長(zhǎng)的選擇為了選擇適宜的檢測(cè)波長(zhǎng),以便最大限度獲取色譜信息滿足建立指紋圖譜的需要,同時(shí),還要兼顧兩個(gè)主要成分的測(cè)定,分別在230,254,280,360nm波長(zhǎng)處考察色譜信息,最終選擇280nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。在選擇流動(dòng)相時(shí),發(fā)現(xiàn)兒茶素只有在流動(dòng)相極性很大的條件下才能完全分離,根皮苷卻要在有機(jī)相比例較大的條件才能有效分離,所以采用梯度洗脫。再比較甲醇水體系和乙腈水系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)乙腈水體系分離效果好于甲醇水體系。3.2地域間不同地域間藥材互作中兒茶素和根皮苷含量差異大,當(dāng)?shù)毓狍w中兒茶素的含量大,當(dāng)?shù)胤植疾畈煌a(chǎn)地鎖陽(yáng)中兒茶素與根皮苷的含量測(cè)定結(jié)果見表6。結(jié)果發(fā)現(xiàn)青海海西州的含量最高,內(nèi)蒙古巴盟的含量最低,各產(chǎn)地藥材中兒茶素與根皮苷的含量差異大,這可能是不同地域生態(tài)環(huán)境的差異導(dǎo)致其中次生代謝產(chǎn)物有較大差別。2.4.1穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果取1號(hào)樣品溶液,分別在