鎖陽(yáng)粗多酚和粗多糖的抗氧化活性比較

鎖陽(yáng)粗多酚和粗多糖的抗氧化活性比較

自由基是一個(gè)沒有得到適當(dāng)電子的生物基。體內(nèi)繼續(xù)產(chǎn)生超氧化鉀、過(guò)氧化氫、羥基離子等自由基。但隨著年齡的增長(zhǎng),人體清除這些自由基的能力在下降。目前認(rèn)為,人類疾病如各種炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化、早老性癡呆、帕金森氏病、急性腦血管病、癌癥、衰老等,均與自由基的氧化刺激密切相關(guān),而傳統(tǒng)的合成抗氧化劑又會(huì)有很多不良反應(yīng)。因此,開發(fā)天然無(wú)害的抗氧化劑迫在眉睫。鎖陽(yáng)CynomoriumsongaricumRupr.是一種重要的荒漠寄生植物,藥食兼用,為內(nèi)蒙古道地藥材。鎖陽(yáng)性甘、溫,具有補(bǔ)腎陽(yáng),益精血,潤(rùn)腸通便的功能。鎖陽(yáng)富含多酚類及多糖類物質(zhì),二者兼有清除體內(nèi)自由基、抗脂質(zhì)氧化、抗衰老、預(yù)防心血管疾病、防癌、防輻射等生物活性,所以鎖陽(yáng)又稱為“不老藥”。目前,對(duì)鎖陽(yáng)的有關(guān)報(bào)道中,以多糖類物質(zhì)為主,如多糖提取工藝的研究,多糖對(duì)染色體端粒長(zhǎng)度的影響等,而抗氧化活性檢測(cè)方面較少。對(duì)于富含的多酚類物質(zhì),只有鞣質(zhì)在含量方面有所報(bào)道,其他鎖陽(yáng)多酚類物質(zhì)報(bào)道的很少。本實(shí)驗(yàn)采用DPPH·法和ABTS+法對(duì)鎖陽(yáng)多酚和多糖進(jìn)行抗氧化測(cè)定并比較,以求找出鎖陽(yáng)中的主要抗氧化成分,為把鎖陽(yáng)開發(fā)為新型天然抗氧化劑提供理論依據(jù)。1材料和機(jī)器1.1獨(dú)貴拉德鎮(zhèn)自然干燥選用的鎖陽(yáng)采自內(nèi)蒙古鄂爾多斯市杭錦旗獨(dú)貴特拉鎮(zhèn),經(jīng)內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物系陳貴林教授鑒定,肉質(zhì)莖自然干燥、粉碎,過(guò)30目篩,干燥后備用。1.2儀器與設(shè)備KUDOSSK7210LHC超聲波清洗器(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司),UV-2450紫外可見分光光度計(jì)(日本島津有限公司),AP-01真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司),BT2202Ssartorious電子天平(北京賽多利斯儀器系列有限公司),XllegraX-15R離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾有限公司),RE-5298旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)。1.3,7,8-四甲基苯并2-硫基苯磺酸酯和5-四甲基苯并2-硫基吡喃-2-羧酸的合成沒食子酸、碳酸鈉、無(wú)水乙醇,葡萄糖、苯酚,濃硫酸,國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?福林酚試劑、DPPH·(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、ABTS+[2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)]、及Trolox(6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸)和維生素E購(gòu)自Sigma公司;抗壞血酸(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)。2方法2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的生產(chǎn)2.1.1碳酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備采用福林酚法,分別取不同濃度的標(biāo)樣沒食子酸溶液(0~15μg·mL-1)2mL,加入福林試劑1.0mL,充分振蕩后靜置3~4min,分別加入10%碳酸鈉溶液1.0mL,搖勻置于25℃恒溫水浴中反應(yīng)2h,于765nm下測(cè)定吸光度,沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線以吸光值A(chǔ)和沒食子酸含量M作回歸方程,見圖1。2.1.2苯酚葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線采用苯酚硫酸法,分別取不同濃度的標(biāo)樣葡萄糖溶液(0~15μg·mL-1)2mL,再各加入5%苯酚試劑1.0mL,搖勻,迅速精密加入濃硫酸5.0mL搖勻,蓋上試管塞靜置25min后以蒸餾水為空白對(duì)照,于490nm下測(cè)定吸光度,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以吸光值A(chǔ)和葡萄糖含量C作回歸方程,見圖2。2.2粗多酚和粗茶多酚的提取2.2.1超聲波輔助提取采用超聲波輔助乙醇法,取鎖陽(yáng)粉末100g以1∶15的料液比與60%乙醇溶液混合,室溫下,在功率為350W超聲波的輔助下進(jìn)行提取,提取時(shí)間8min,抽濾。乙醇提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將乙醇相旋蒸。剩余水相依次用石油醚、三氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇萃取,每種溶劑萃取3次,每次3h,將醋酸乙酯相和正丁醇相真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)。然后用甲醇將兩相旋蒸的剩余部分合并,置于通風(fēng)廚中直至樣品干燥,然后將所得固體研磨成粉末得到4.09g,放于干燥陰涼處備用。2.2.2渣的自然干燥采用水提醇沉法,取鎖陽(yáng)粉末100g,加入95%的乙醇按1∶12的料液比進(jìn)行浸提,浸提12h后,除去上清液,濾渣自然干燥。將干燥后的濾渣用蒸餾水以1∶12的料液比在97℃下回流提取3h,分別收集上清液和濾渣備用。將收集到的濾渣按上述方法再次回流提取,合并兩次提取液。將提取液減壓濃縮至總體積約120mL,然后加入95%乙醇至乙醇濃度達(dá)80%后進(jìn)行醇沉,12h后收集沉淀,沉淀即為粗提多糖,待沉淀自然干燥后將其研磨成粉末得到8.05g,放于干燥陰涼處備用。2.3多糖含量及多糖來(lái)源同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作相同,多酚含量以mg沒食子酸/g粗提多酚表示,為(922.9±25.2)mgGAE·g-1。多糖含量以mg葡萄糖/g粗提多糖表示為(366.6±15.9)mg·g-1。粗多酚含量為粗多糖的2.5倍。2.4抗逆效應(yīng)的測(cè)定2.4.1清除率測(cè)定參照GollueckeAPB等的方法,取2mL不同濃度的樣品液(每個(gè)濃度重復(fù)3次)進(jìn)行測(cè)定。按照下列公式計(jì)算清除率:清除率%=[A1-(A-B)]/A1×100%式中,A為2mLDPPH·溶液+2mL樣品液的吸光度;B為2mL樣品液+2mL乙醇的吸光度;A1為2mLDPPH·溶液+2mL乙醇的吸光度。將鎖陽(yáng)粗多酚和粗多糖清除自由基的能力與維生素C、維生素E清除自由基的能力IC50值相比較,即清除一半自由基時(shí)所需的樣品濃度,確定其相對(duì)抗氧化活性。2.4.2相對(duì)抗氧化活性的測(cè)定參照RobertaRe等的方法測(cè)定,取30μL不同濃度的樣品液(每個(gè)濃度重復(fù)3次)進(jìn)行測(cè)定,將鎖陽(yáng)粗多酚和粗多糖清除自由基的能力與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)Trolox清除自由基的能力相比較,轉(zhuǎn)化成TEAC值,即達(dá)到一定濃度測(cè)試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox的濃度,確定其相對(duì)抗氧化活性。Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為Y=4.553X+0.818,r=0.997。3結(jié)果3.1系統(tǒng)測(cè)定粗多糖的ic50DPPH·法測(cè)定鎖陽(yáng)粗多酚和粗多糖抗氧化活性是通過(guò)DPPH·的清除率來(lái)表示的,即IC50值越小,表明抗氧化活性越大。鎖陽(yáng)粗多酚IC50值為79.3μg·mL-1,粗多糖IC50值為145.6μg·mL-1。粗多酚的IC50為粗多糖的54%,即粗多酚抗氧化活性為粗多糖的1.8倍,見圖3。3.2abts+自由基清除能力的測(cè)定TEAC值表示為達(dá)到一定質(zhì)量濃度測(cè)試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰猅rolox的濃度,TEAC值越大,表明抗氧化活性越大。對(duì)于ABTS+自由基的清除能力,將各樣品清除ABTS+的能力按Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)化成TEAC值,鎖陽(yáng)粗多酚TEAC值為2.12mmol·g-1,粗多糖TEAC值為0.69mmol·g-1。粗多酚的TEAC值為粗多糖的3.1倍,見圖4。4鎖陽(yáng)多糖的抗氧化活性本實(shí)驗(yàn)中鎖陽(yáng)粗多酚含量為粗多糖含量的2.5倍。100g鎖陽(yáng)粉末中沒食子酸當(dāng)量為葡萄糖當(dāng)量的1.3倍。DPPH·法和ABTS+法測(cè)定鎖陽(yáng)粗多酚和粗多糖的抗氧化活性基本一致,DPPH·法檢測(cè)粗多酚抗氧化能力為粗多糖的2倍,ABTS+法檢測(cè)粗多酚抗氧化能力為粗多糖的3.1倍,結(jié)果表明鎖陽(yáng)粗多酚的抗氧化活性遠(yuǎn)高于粗多糖。因此,多酚可視為是鎖陽(yáng)的主要抗氧化成分之一。雖然鎖陽(yáng)粗多酚和粗多糖的抗氧化活性不如維生素C和維生素E,但鎖陽(yáng)中除了多酚和多糖外還有其他的抗氧化成分,如花青素類,三萜類等。鎖陽(yáng)作為整體入藥,其所有的抗氧化成分的抗氧化活性相加后要優(yōu)于單一成份的抗氧化劑維生素C和維生素E。一般認(rèn)為水果中起抗氧化作用的成分主要是維生素C,但有研究通過(guò)對(duì)比了15種水果及33種蔬菜的抗氧化活性與維生素C含量的關(guān)系,表明其抗氧化活性與維生素C含量無(wú)明顯的相關(guān)關(guān)系。而且鎖陽(yáng)作為中藥入藥,其功能不止抗氧化一種,其他功能如補(bǔ)腎、助陽(yáng)、益精、潤(rùn)腸等維生素C和維生素E卻未必有。最近的研究表明,鎖陽(yáng)多糖可以通過(guò)抑制D-半乳糖衰老小鼠血細(xì)胞和腦細(xì)胞染色體末端端粒長(zhǎng)