凝膠層析法分離純化蛋白質(zhì)

凝膠層析法別離純化蛋白質(zhì).【目的】掌握凝膠層析的根本原理學(xué)習(xí)利用凝膠層析法別離純化蛋白質(zhì)的實驗技能.

【原理】凝膠層析也稱分子篩層析、排阻層析。是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠的分子篩作用，根據(jù)被別離物質(zhì)的分子大小不同來進(jìn)行別離的技術(shù)。.凝膠層析是按照蛋白質(zhì)分子量大小進(jìn)行別離的技術(shù)，又稱之凝膠過濾、分子篩層析或排阻層析。單個凝膠珠本身象“篩子〞。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。凝膠過濾層析.帶網(wǎng)孔的葡聚糖珠小分子進(jìn)入葡聚糖珠內(nèi)大分子不能進(jìn)入珠內(nèi)，經(jīng)珠之間縫隙流出凝膠過濾層析過程示意圖.凝膠過濾層析過程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠.總結(jié)：相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動，因此流程較短，移動速度快；所以首先流出。相對分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動過程中，因此流程較長，移動速率慢；所以最后流出。中等大小的分子，它們在凝膠顆粒內(nèi)外局部滲透，滲透的程度取決于它們分子的大小，所以它們流出的時間介于二者之間，這樣分子大的組分先流出，分子小的組分后流出。這樣樣品經(jīng)過凝膠層析后，各個組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而到達(dá)了別離的目的。.【實驗器材】層析柱恒流泵紫外檢測儀局部收集器試管等普通玻璃器皿.....【實驗試劑】待別離樣品葡聚糖凝膠SephadexG-100洗脫液：0.1mol/LpH6.8磷酸緩沖液.【操作方法】一、凝膠的處理

SephadexG-100干粉經(jīng)蒸餾水室溫充分溶脹48h，或沸水浴中煮沸2h，冷卻至室溫后抽真空脫去顆粒空隙中的空氣。

.二、裝柱關(guān)閉出口，向柱內(nèi)參加洗脫液約1cm高，將濃漿狀的凝膠緩慢地傾入柱中，使之自然沉降，凝膠沉降約1㎝高度后翻開出水口，繼續(xù)參加凝膠漿，直到凝膠沉積至一定高度即可。裝柱要求連續(xù)，均與，無氣泡，無“紋路〞。.三、平衡將洗脫液與恒流泵相連，恒流泵出口端與層析柱入口相連，用2～3倍柱床體積的洗脫液平衡，流速為0.5ml/min。.四、加樣與洗脫將柱中多余的液體放掉出，使液面剛好蓋過凝膠，關(guān)閉出口，將1ml樣品沿層析柱管壁小心參加，加完后翻開底端出口，使液面降至與凝膠面相平時關(guān)閉出口，加洗脫液至液層4cm左右，接上恒流泵，開始洗脫〔0.5ml/min〕。.五、收集與測定用局部收集器收集洗脫液。紫外檢測儀280nm處檢測，將檢測信號輸入色譜工作站系統(tǒng)，繪制洗脫曲線。.六、凝膠柱的處理凝膠用過后，反復(fù)用蒸餾水通過柱〔2~3倍床體積〕即可。.本卷須知各接頭不能漏氣，連續(xù)用的小乳膠管不要有破損，否那么造成漏氣、漏液。注意恒壓瓶內(nèi)的排氣管應(yīng)無液體，并隨著柱下口溶液的流出不斷有氣泡產(chǎn)生，那么表示恒壓瓶不漏氣。操作過程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，那么表示整個系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細(xì)檢查并加以糾正。始終保持柱內(nèi)液面