華中農(nóng)業(yè)生化考研01ProteinB(127-6)

第三節(jié)

蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)

一、蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和纖維狀蛋白質(zhì)（一）肽鏈的構(gòu)象（conformation）

在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)只有一種或很少幾種穩(wěn)定構(gòu)象，這種構(gòu)象稱(chēng)天然構(gòu)象。天然構(gòu)象的蛋白質(zhì)具有生物活性，主鏈上的單鍵一般不能自由旋轉(zhuǎn)。1.肽鏈的二面角（dihedralangle）C2C2αC1N2N3二面角（Φ、Ψ）C1αC3α

C2α原子有兩個(gè)單鍵，能自由旋轉(zhuǎn)。

繞C2α－N2鍵旋轉(zhuǎn)的角度為Φ

繞C2α－C2鍵旋轉(zhuǎn)的角度稱(chēng)Ψ旋轉(zhuǎn)Φ使得C1－N2和C2α－C2呈順式，Φ=0°

旋轉(zhuǎn)Ψ使得N3－C2和N2－C2α呈順式，Ψ=0°

從C2α向N2方向看，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)C2α－N2鍵

Φ角為正值，反之為負(fù)值。從C2α向C2方向看，順時(shí)針旋轉(zhuǎn)C2α－C2鍵

Ψ角為正值，反之為負(fù)值。2.多肽鏈折疊的空間限制

Φ和Ψ同時(shí)為0的構(gòu)象實(shí)際不存在二面角（Φ、Ψ）所決定的構(gòu)象能否存在，主要取決于兩個(gè)相鄰肽單位中非鍵合原子間的接近有無(wú)阻礙。

Cα上的R基的大小與帶電性也影響Φ和ΨP206表5－3

蛋白質(zhì)中非鍵合原子間的最小接觸距離拉氏構(gòu)象圖：

Ramachandran根據(jù)蛋白質(zhì)中非鍵合原子（non-covelently-bondedatom）間的最小接觸距離，確定了二面角（Φ、Ψ）存在的區(qū)域。以Φ為橫坐標(biāo)，以Ψ為縱坐標(biāo)，在圖上標(biāo)出二面角（Φ、Ψ）可能存在的區(qū)域，該圖稱(chēng)拉氏構(gòu)象圖。

Gly除外

拉氏構(gòu)象圖⑴實(shí)線封閉區(qū)域（一般允許區(qū)）非鍵合原子間的距離大于一般允許距離，此區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的構(gòu)象都是允許的，且構(gòu)象穩(wěn)定。⑵虛線封閉區(qū)域（最大允許區(qū)）非鍵合原子間的距離介于最小允許距離和一般允許距離之間，立體化學(xué)允許，但構(gòu)象不夠穩(wěn)定。⑶虛線外區(qū)域（不允許區(qū)）該區(qū)域內(nèi)任何二面角確定的肽鏈構(gòu)象，非鍵合原子間距離小于最小允許距離。除Gly以外的氨基酸，一般允許區(qū)占全平面的7.7%，最大允許區(qū)占全平面20.3％（二）二級(jí)結(jié)構(gòu)的基本類(lèi)型驅(qū)使蛋白質(zhì)折疊的主要?jiǎng)恿Γ匦?yīng)

A.暴露在溶劑中的疏水基團(tuán)降低至最少程度

B.要保持處于伸展?fàn)顟B(tài)的多肽鏈和周?chē)肿娱g形成的氫鍵相互作用的有利能量狀態(tài)1.α螺旋（α-helix）（1）特征多肽主鏈按右手或左手方向盤(pán)繞，形成右手或左手螺旋，相鄰的螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鍵，構(gòu)成螺旋的每個(gè)Cα都有相同的二面角。α-螺旋典型α螺旋（3.613）的特征：A.二面角Φ=-57°,Ψ=-48°，右手螺旋

B.每圈3.6個(gè)氨基酸殘基，高度0.54nmC.每個(gè)殘基繞軸旋轉(zhuǎn)100°，沿軸上升0.15nmD.氨基酸殘基側(cè)鏈向外E.相鄰螺圈之間形成鏈內(nèi)氫鏈，氫鍵的取向幾乎與中心軸平行F.肽鍵上的C=0氧與它后面第四個(gè)殘基上的N-H

氫間形成氫鍵α-螺旋截面典型的α螺旋用3.613表示，3.6表示每圈螺旋包括3.6個(gè)殘基，13表示氫鍵封閉的環(huán)包括13個(gè)原子。封閉環(huán)原子數(shù)3n+4（n=1、2、）

2.27螺旋（n=1）

310螺旋（n=2）

3.613螺旋（n=3）

4.316螺旋（n=4）

n表示從第一個(gè)酰胺平面開(kāi)始，增加的酰胺平面數(shù)（見(jiàn)下圖）2.27螺旋、310

螺旋、3.613螺旋、4.316螺旋

（2）R側(cè)鏈對(duì)α-螺旋穩(wěn)定性的影響

R側(cè)鏈的大小和電荷決定了α-螺旋的穩(wěn)定性A.多肽鏈上連續(xù)出現(xiàn)帶同種電荷的氨基酸殘基，不能形成穩(wěn)定的α-螺旋，如多聚Lys、多聚GluB.Gly的Φ角和Ψ角可取較大范圍，在肽中連續(xù)存在時(shí)，不易形成α-螺旋C.R基大的氨基酸不易形成α-螺旋，例如IleD.R基較小，且不帶電荷的氨基酸利于α-螺旋的形成，如多聚Phe，在pH7的水溶液中自發(fā)卷曲成α-螺旋E.Pro中止α-螺旋（3）pH對(duì)α-螺旋的影響多聚L-Glu和多聚L-Lys（4）右手α-螺旋與左手α-螺旋右手螺旋比左手螺旋穩(wěn)定蛋白質(zhì)中的α-螺旋幾乎都是右手螺旋。但也有例外，在嗜熱菌蛋白酶中有很短的一段左手α-螺旋，由Asp-Asn-Gly-Gly（226-229）組成（φ+64°、Ψ+42°）（5）α-螺旋結(jié)構(gòu)的旋光性由于α-螺旋結(jié)構(gòu)是一種不對(duì)稱(chēng)的分子結(jié)構(gòu)，因而具有旋光性。

A.α碳原子的不對(duì)稱(chēng)性

B.構(gòu)象本身的不對(duì)稱(chēng)性天然α-螺旋能引起偏振光右旋

α-螺旋的比旋不等于氨基酸比旋的加和，而無(wú)規(guī)卷曲短肽鏈的比旋等于所有氨基酸比旋之和。2.β-pleatedsheet

β-折疊

兩條或多條伸展的多肽鏈側(cè)向聚集，相鄰肽鏈主鏈上的NH和C=0之間形成氫鏈。

β-折疊中所有的肽鏈都形成鏈間氫鍵，側(cè)鏈R基交替地分布在片層平面的兩側(cè)。

Parallel：β-折疊肽鏈的N端在同一側(cè)

φ=-119°，Ψ=+113°

Antiparallel：肽鏈的極性顛倒，N端間隔相同

φ=-139°，Ψ=+135°

纖維狀蛋白質(zhì)中，β-折疊主要是反平行式，球狀蛋白質(zhì)中兩種方式都存在。在纖維狀蛋白質(zhì)的β-折疊中，氫鍵主要是在肽鏈之間形成；而在球狀蛋白質(zhì)中，β-折疊既可在不同肽鏈間形成，也可在同一肽鏈的不同部分之間形成。3.β-turn

β-回折（reverseturn）、β-彎曲（β-bend）

肽鏈出現(xiàn)的180°回折，由第一個(gè)氨基酸殘基的C=O與第四個(gè)氨基酸殘基的N-H間形成氫鍵。

β轉(zhuǎn)角的特征：

A.4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成

B.主鏈骨架180°折疊

C.第一個(gè)氨基酸殘基的C=O與第四個(gè)氨基酸殘基的N-H形成氫鍵

D.C1α與C4α之間距離小于0.7nmE.多數(shù)由親水氨基酸殘基組成4.無(wú)規(guī)卷曲沒(méi)有規(guī)律的多肽鏈主鏈骨架構(gòu)象，往往與生物活性有關(guān)。

α-螺旋、β-折疊在拉氏構(gòu)象圖上有固定的位置，而無(wú)規(guī)卷曲的φ、Ψ二面角可存在于所有允許區(qū)域內(nèi)。三、超二級(jí)結(jié)構(gòu)（super-secondarystructure）

若干個(gè)相鄰的二級(jí)結(jié)構(gòu)單元（α-螺旋、

β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲）組合在一起，形成規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)組合體。1.復(fù)繞α-螺旋（αα結(jié)構(gòu)）由兩股或三股右手α-螺旋纏繞形成的左手螺旋，存在于α-角蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋和纖維蛋白原中。蛋白質(zhì)超二級(jí)結(jié)構(gòu)2.βxβ結(jié)構(gòu)兩個(gè)平行式的β-折疊通過(guò)一段連接鏈（x結(jié)構(gòu)）連接而形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)。

①βcβx為無(wú)規(guī)卷曲

②βαβx為α-螺旋，最常見(jiàn)的是βαβαβ，存在于蘋(píng)果酸脫氫酶和乳酸脫氫酶中

3.β曲折（β-meander）由三條（以上）相鄰的反平行式的β-折疊鏈通過(guò)緊湊的β-轉(zhuǎn)角連接而形成的超二級(jí)結(jié)構(gòu)

4.回形拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（希臘鑰匙）

5.β-折疊桶多條β-折疊構(gòu)成的β-折疊層，卷成一個(gè)筒狀結(jié)構(gòu)，筒上β折疊可以是平行的或反平行的，一般由5-15條β-折疊股組成。超氧化物歧化酶的β-折疊筒由8條β-折疊股組成。筒中心由疏水氨基酸殘基組成。6.α-螺旋-β轉(zhuǎn)角-α-螺旋兩個(gè)α-螺旋通過(guò)一個(gè)β轉(zhuǎn)角連接在一起

λ噬菌體的λ阻遏蛋白含此結(jié)構(gòu)四、纖維狀蛋白質(zhì)軸比大于10，含大量的α-螺旋或β-折疊，占脊椎動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的50%以上，起支架和保護(hù)作用。

1.角蛋白源于外胚層細(xì)胞，包括皮膚及皮膚的衍生物，可分成α角蛋白和β角蛋白。（1）α角蛋白（毛發(fā)）主要由α-螺旋組成，三股右手α-螺旋向左纏繞形成原纖維，原纖維排列成“9+2”的電纜式結(jié)構(gòu)稱(chēng)微纖維，成百根微纖維結(jié)合成大纖微。

Cys含量較高，二硫鍵保證結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

α-角蛋白在濕熱條件下可伸展轉(zhuǎn)變成β-構(gòu)象。

α角蛋白燙發(fā)的化學(xué)機(jī)理（2）β-角蛋白（絲心蛋白）

以β-折疊結(jié)構(gòu)為主反平行式β-折疊片的堆積，鏈間主要以氫鍵結(jié)合，層間主要靠范德華力維系。富含Gly、Ala、Ser絲心蛋白2.膠原蛋白3.彈性蛋白4.肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白和微管蛋白第四節(jié)

球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定高級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈的二級(jí)結(jié)構(gòu)由R基的短程順序決定，當(dāng)一組在肽鏈上相鄰的氨基酸殘基具有適當(dāng)?shù)捻樞驎r(shí)，能自發(fā)形成α-螺旋和β-折疊，并處于穩(wěn)定狀態(tài)。而多肽鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)由氨基酸的長(zhǎng)程順序決定，如產(chǎn)生特異轉(zhuǎn)彎的氨基酸殘基（Pro、Thr、Ser）的精確位置，決定多肽鏈轉(zhuǎn)彎形成的方向和角度。

同源蛋白質(zhì)的不變殘基決定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)功能的復(fù)雜性和多樣性是建立在結(jié)構(gòu)多樣性基礎(chǔ)上的。

RNase的變性、復(fù)性實(shí)驗(yàn)證明，蛋白質(zhì)三維構(gòu)象的形成，是生物大分子“自我折疊、自我裝配”的過(guò)程。二、球狀蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、三級(jí)結(jié)構(gòu)與功能結(jié)構(gòu)域（domain）和模體（motif）

在二級(jí)結(jié)構(gòu)及超二級(jí)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈進(jìn)一步卷曲折疊，組裝成幾個(gè)相對(duì)獨(dú)立的、近似球形的三維實(shí)體。結(jié)構(gòu)域（domain）

A.結(jié)構(gòu)域是球狀蛋白的折疊單位。

B.較小的蛋白質(zhì)分子或亞基往往是單結(jié)構(gòu)域。

C.結(jié)構(gòu)域一般有１００－２００氨基酸殘基。

D.結(jié)構(gòu)域之間常常有一段柔性的肽段相連，形成鉸鏈區(qū)，使結(jié)構(gòu)域之間可以發(fā)生相對(duì)移動(dòng)。

E.結(jié)構(gòu)域承擔(dān)一定的生物學(xué)功能，幾個(gè)結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用，可體現(xiàn)出蛋白質(zhì)的總體功能。

F.結(jié)構(gòu)域間的裂縫，常是酶的活性部位，也是反應(yīng)物的出入口。模體motif（基序）在對(duì)核酸或蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性比較研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)很多核酸或蛋白質(zhì)（包括一些功能不同的核酸或蛋白質(zhì)）都可能含有相似的結(jié)構(gòu)方式。

早年的注意力局限在一級(jí)結(jié)構(gòu)上，近年也用于比較蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性模體（motif）EF手：鈣結(jié)合蛋白中，含有Helix-Loop-Helix結(jié)構(gòu)。鋅指：DNA結(jié)合蛋白中，2個(gè)His、2個(gè)Cys結(jié)合一個(gè)Zn。亮氨酸拉鏈：DNA結(jié)合蛋白中，由亮氨酸側(cè)鏈形成的拉鏈?zhǔn)浇Y(jié)構(gòu)。調(diào)控蛋白的模體結(jié)構(gòu)（一）三級(jí)結(jié)構(gòu)多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)、超二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域的基礎(chǔ)上盤(pán)旋、折疊，形成的特定的空間結(jié)構(gòu)。1.三級(jí)結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)A.在一級(jí)結(jié)構(gòu)上相差很遠(yuǎn)的氨基酸殘基在三級(jí)結(jié)構(gòu)上可能相距很近B.球形蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)很密實(shí)，內(nèi)部是一疏水核C.大的球形蛋白含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域2.維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力A.氫鍵B.范德華力（分子間及基團(tuán)間作用力）定向效應(yīng)：極性基團(tuán)間誘導(dǎo)效應(yīng)：極性與非極性基團(tuán)間色散效應(yīng)：非極性基團(tuán)間C.疏水相互作用D.離子鍵（鹽鍵）E.二硫鍵二硫鍵不指導(dǎo)多肽鏈的折疊，但三級(jí)結(jié)構(gòu)形成后可穩(wěn)定構(gòu)象。維持三級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力（二）肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)與功能

1.肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)

肌紅蛋白結(jié)構(gòu)肌紅蛋白分子大?。?.5×3.5×2.5nm

氨基酸殘基：153

輔基：血紅素

多肽鏈由8段α-螺旋組成，最長(zhǎng)的α-螺旋有23個(gè)氨基酸，最短的有7個(gè)氨基酸，分子中幾乎80%的氨基酸在α-螺旋區(qū)內(nèi)。哺乳動(dòng)物肌肉中儲(chǔ)氧氣，由一條多肽鏈和一個(gè)血紅素輔基組成，球狀分子，單結(jié)構(gòu)域。

8段α-螺旋（A、B、C…H），松散肽段連接兩個(gè)相鄰α-螺旋。

4個(gè)Pro殘基分別位于一個(gè)拐彎處，Ser、Thr、Asn、Ile也在拐彎處。

輔基：血紅素（卟啉鐵），扁平狀，結(jié)合在肌紅蛋白的一個(gè)洞穴內(nèi)。

原卟啉血紅素（卟啉鐵）鐵離子的配位鍵F8HisO2和CO分別與肌紅蛋白結(jié)合肌紅蛋白和血紅蛋白中的血紅素2.肌紅蛋白的氧合曲線解離平衡：MbO2Mb+O2

解離平衡常數(shù)：在給定氧壓下肌紅蛋白的飽和度：

肌紅蛋白的氧合曲線當(dāng)Y=1時(shí)，所有肌紅蛋白的氧合位置均被占據(jù)，肌紅蛋白被氧飽和，K=0Y=0.5時(shí)，肌紅蛋白一半的氧合位點(diǎn)被飽和，

PO2=K，解離常數(shù)K稱(chēng)為P50，即肌紅蛋白一半被飽和時(shí)的氧壓。三、蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)與功能

1.蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)多個(gè)具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的亞基，通過(guò)非共價(jià)鍵聚集形成的特定構(gòu)象。維持四級(jí)結(jié)構(gòu)的作用力：氫鍵、疏水作用、靜電作用多個(gè)亞基聚集成四級(jí)結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢(shì)：

A.比表面積減小，穩(wěn)定性增強(qiáng)

B.提高遺傳經(jīng)濟(jì)性

C.各種酶分子聚體在一起，提高催化效率

D.具有協(xié)同效應(yīng)和別構(gòu)效應(yīng)2.血紅蛋白的結(jié)構(gòu)與功能A.血紅蛋白的結(jié)構(gòu)成人：HbA,α2β2,98%；HbA2,α2δ2,2%

胎兒：HbA,HbA2；HbF,α2γ2

4個(gè)亞基分別在四面體的四個(gè)角上，每個(gè)亞基上有一個(gè)血紅素輔基。血紅蛋白α、β鏈的三級(jí)結(jié)構(gòu)與肌紅蛋白的很相似，但這三種肽鏈的氨基酸順序有較大不同，141個(gè)氨基酸中有20多個(gè)相同。B.血紅蛋白的氧合曲線

四個(gè)亞基具有正協(xié)同效應(yīng)，氧合曲線是S型。

協(xié)同效應(yīng)可增加血紅蛋白在肌肉中的卸氧量，能更有效地輸送氧氣。血紅蛋白P50=26torr

肺泡氧壓Po2=100torr，血紅蛋白Y=0.97

肌肉毛細(xì)血管Po2=20torr，血紅蛋白Y=0.25

氧釋放量△Y=0.97－0.25=0.72

肌紅蛋白P50=1torr

在20torr時(shí)，肌紅蛋Y≈1

C.波耳（Bohr）效應(yīng)

CO2和pH可改變血紅蛋白的氧合曲線

波耳效應(yīng)：增加CO2濃度或降低pH，能顯著增強(qiáng)血紅蛋白亞基間的正協(xié)同效應(yīng)，降低血紅蛋白對(duì)O2的親和力，促進(jìn)

O2的釋放。高濃度的O2也能促使血紅蛋白釋放CO2

波耳（Bohr）效應(yīng)D.二磷酸甘油酸（DPG）引起的別構(gòu)效應(yīng)血紅蛋白是一個(gè)別構(gòu)蛋白，DPG是它的負(fù)效應(yīng)物。無(wú)DPG時(shí)，血紅蛋白P50=1torrDPG=4.5mM時(shí)，P50=26torrDPG與血紅蛋白的兩個(gè)β亞基形成鹽鍵穩(wěn)定了血紅蛋白脫氧態(tài)的構(gòu)象，降低了脫氧血紅蛋白與氧的親和力，加大了血紅蛋白的卸氧量，提高了血紅蛋白的輸氧效率。四、免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

1.抗原與抗體（Antigen、Antibody）

抗原是指進(jìn)入異體機(jī)體后，能致敏淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異抗體，并能與抗體特異結(jié)合的蛋白質(zhì)及其它高分子化合物?？乖瓫Q定簇：抗原性由抗原分子表面特殊的化學(xué)基團(tuán)決定（一級(jí)結(jié)構(gòu)或空間結(jié)構(gòu)），這種決定原性的化學(xué)基團(tuán)稱(chēng)抗原決定簇（表位epitope

）?？乖瓫Q定簇（antigenicdeterminant）的作用A.被免疫活性細(xì)胞識(shí)別，激活免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生抗體B.與相應(yīng)抗體結(jié)合抗原表位預(yù)測(cè)網(wǎng)址：

http:///Tools/antigenic.plXM_545853perilipinprotein（dog）MAVNKGPTLPDGDLPEQENVLQRVLQLPVVSGTCECFQKTYTSTKEAYPLVASVCNAYEKGVQGASSLAAWSMEPVVRRLSTQFTAANELACRGLDHLEEKIPALQYPPEKIASELKDTISTRLRSARNSISVPIASTSDKVLGAALASCELAWGVAKDTAEYAANTRAGRLASGGADLALGGVEKVVEFLLPSAKEDSAPAPGHQQTQKPPKAKPSLVHRVGALANILSRHTFQTTARALKQGQALAMWIPGVAPLSSLAQWGASVAMQVVPRRQSEVRVPWLHNLTASQEEDHNDQTDTEGEETEEEESDTEENKLSEVAALPSPQGLLGSVAHTLQKAVQSTISAVTWAPAAVLGSAARMLHLAPARAVSSTKGRAMSLSDALKGVTDNVVDTVVHYVPSSRNILTNCTLDEGGPLLARQRVRETRGVQTVWEGGCRPPLGVGPGDRRRGHAVRVSPARAQSHPRRCAPEGRSREARARRSLRKAGGRRGDGVQAGDPDAPPRPQLPRLSLMEPESEFRDIEEAGRREAERRASGAPEPTPRPPQPRGGPRPARGPGAPPGPGPEDRLDAPAAPRPAFPAAAREKPTRRVSDSFFRPSVMEPILGRAQYSQLRKKS抗體是在對(duì)抗原刺激的免疫應(yīng)答中，B淋巴細(xì)

胞產(chǎn)生的一類(lèi)糖蛋白，它是能與相應(yīng)抗原特異性

結(jié)合、產(chǎn)生免疫反應(yīng)的球蛋白，稱(chēng)免疫球蛋白。

Immunoglobulin

抗體具有兩個(gè)特點(diǎn)：

A.高度特異性

B.多樣性

幾乎所有的外源蛋白都能誘導(dǎo)相應(yīng)的特異性抗

體，人體內(nèi)約有108種抗體，任一時(shí)刻約有10000種。2.抗原抗體結(jié)合抗原抗體結(jié)合的條件

A.抗原決定簇與抗體結(jié)合部位構(gòu)象互補(bǔ)

B.二者各有對(duì)應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)，通過(guò)作用力使二者結(jié)合（離子鍵、氫鍵等）

抗體是2價(jià)的，抗原是多價(jià)的?？贵w過(guò)剩:抗原分子所有價(jià)被抗體的飽和，可溶抗原－抗體比例適中：形成網(wǎng)狀的抗原-抗體復(fù)合物，不可溶抗原過(guò)剩：抗體被飽和，可溶ELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）

ELISA

免疫印跡分析（immunoblotassay）

WesternBlot

抗原與抗體結(jié)合用于檢測(cè)微量的蛋白質(zhì)WesternBlot第五節(jié)

蛋白質(zhì)的性質(zhì)及應(yīng)用一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)可解離基團(tuán)主要是側(cè)鏈基團(tuán)，少數(shù)N端-NH2和C端-COOH。1.蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)

等電點(diǎn)與蛋白質(zhì)中所含的酸性氨基酸、堿性氨基酸的比例有關(guān)。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的電導(dǎo)性、溶解度、和粘度最小。

聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳2.蛋白質(zhì)的電泳分離聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGE（荷質(zhì)比不同）

SDS（荷質(zhì)比相同，分子量不同）

聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳（等電點(diǎn)差異）3.離子交換層析分離蛋白質(zhì)與氨基酸分離原理相似二、膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)的沉淀蛋白質(zhì)分子直徑1-100nm，在水溶液是中具有膠體性質(zhì)（布朗運(yùn)動(dòng)，丁達(dá)耳現(xiàn)象，不能通過(guò)半透膜）。透析：將含小分子雜質(zhì)的蛋白質(zhì)放入透析袋，置水中，小分子雜質(zhì)不斷從袋中出來(lái)，大分子蛋白質(zhì)仍留在袋中。蛋白質(zhì)的溶解度取決于氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的極性，離子化基團(tuán)的數(shù)量。1.穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體溶液的主要因素

A.蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成水化膜

B.非等電狀態(tài)時(shí)，同種電荷的互相排斥2.沉淀蛋白質(zhì)的方法

A.鹽析法高濃度的中性鹽[（NH4）2SO4、Na2SO4、

NaCl]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀

B.有機(jī)溶劑沉淀法破壞水化膜，降低介電常數(shù)C.重金屬鹽沉淀與重金屬（Hg2+.Pb2+.Cu2+

）生成不溶性沉淀D.生物堿和某些酸類(lèi)沉淀法

pH小于等電時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類(lèi)的負(fù)離子生成沉淀生物堿試劑：?jiǎn)螌幩?、苦味酸、鎢酸