基于線粒體dna技術(shù)的花生根結(jié)線蟲(chóng)種群遺傳效應(yīng)研究

基于線粒體dna技術(shù)的花生根結(jié)線蟲(chóng)種群遺傳效應(yīng)研究

根結(jié)線蟲(chóng)是一種廣泛分布于世界上、種類(lèi)多、寄主范圍廣的植物固結(jié)線蟲(chóng)。世界每年由根結(jié)線蟲(chóng)所引起經(jīng)濟(jì)上重要農(nóng)作物的損失占總損失的5%,其中以南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)、花生根結(jié)線蟲(chóng)(M.arenaria)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)(M.javanica)為主。由于采用殺線蟲(chóng)劑防治根結(jié)線蟲(chóng)會(huì)增加環(huán)境的污染,選用抗性品種和作物輪作方法是當(dāng)前較好的控制措施,而這2種方法需要對(duì)根結(jié)線蟲(chóng)的種和小種進(jìn)行準(zhǔn)確、快速的鑒定。傳統(tǒng)的根結(jié)線蟲(chóng)分類(lèi)鑒定是根據(jù)線蟲(chóng)形態(tài)學(xué)、鑒別寄主反應(yīng)及細(xì)胞遺傳學(xué)等方法,但由于它們自身的局限性而不能達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒定的目的。在線蟲(chóng)學(xué)的研究中,現(xiàn)在可以利用rDNA-ITS的差異作為一些傘滑刃線蟲(chóng)(Bursaphelenchusspp.)和莖線蟲(chóng)(Ditylenchusspp.)種的鑒定依據(jù)。在根結(jié)線蟲(chóng)屬中,雖然北方根結(jié)線蟲(chóng)(M.hapla)、奇氏根結(jié)線蟲(chóng)(M.chitwoodi)和偽根結(jié)線蟲(chóng)(M.fallax)的鑒定可以依據(jù)rDNA-ITS的PCR-RFLP或rDNA-IGS的PCR差異來(lái)區(qū)分,但南方根結(jié)線蟲(chóng)、花生根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的ITS1和ITS2區(qū)差異很小,因而利用rDNA-ITS很難有效地區(qū)分這3種主要根結(jié)線蟲(chóng)的種類(lèi)。線粒體DNA(mitochondrialDNA,mtDNA)在細(xì)胞中具有多拷貝、堿基序列比基因組小、典型的母性遺傳方式和進(jìn)化速率快的特點(diǎn),是生物體進(jìn)行分類(lèi)與進(jìn)化研究的理想?yún)^(qū)域。Okimoto等對(duì)爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的mtDNA測(cè)序表明:根結(jié)線蟲(chóng)的mtDNA是1個(gè)閉合的環(huán)狀分子,它含有2個(gè)rRNA基因,22個(gè)tRNA基因,12個(gè)與氧化磷酸化相關(guān)的基因?；蜷g含有1個(gè)約7kb的調(diào)控區(qū),這個(gè)區(qū)攜帶3組可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)單元,即8、63、102bp重復(fù)單元。目前,已對(duì)63bp的重復(fù)單元測(cè)序,并可以根據(jù)設(shè)計(jì)出的專(zhuān)化性引物擴(kuò)增63bp單元。由于這些串聯(lián)重復(fù)單元的高度變異,因此常用它來(lái)進(jìn)行根結(jié)線蟲(chóng)種內(nèi)和種間的多態(tài)性研究。而mtDNA的COⅡ和LrRNA基因間的序列相對(duì)保守,可利用這個(gè)區(qū)域進(jìn)行根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定的研究。本研究應(yīng)用PCR和酶切實(shí)驗(yàn),著重對(duì)來(lái)自我國(guó)的42個(gè)種群mtDNA的COⅡ和LrRNA基因間的序列進(jìn)行研究,以明確其在根結(jié)線蟲(chóng)種類(lèi)鑒定中的作用。1材料和方法1.1試驗(yàn)根結(jié)線蟲(chóng)群用于實(shí)驗(yàn)的根結(jié)線蟲(chóng)種群共42個(gè),來(lái)源及寄主見(jiàn)表1。所有種群是經(jīng)過(guò)單卵塊純化并繁殖于溫室番茄中。1.2酶活的檢測(cè)參考Esbenshade等實(shí)驗(yàn)方法稍作改動(dòng)。采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-Ⅲ-6B型電泳儀,DYY-Ⅲ-23A型垂直板電泳槽,凝膠板大小為125mm×100mm,凝膠厚度1mm。分離膠和濃縮膠同源,電極緩沖液是pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。酶浸提液為20%蔗糖(w/v)和2%TritonX-100,每個(gè)種群挑取4個(gè)年輕雌蟲(chóng)制成1個(gè)樣品。用50μL微量取樣器加樣,每孔30μL(約含5μL溴酚藍(lán)溶液),以已知種群爪哇根結(jié)線蟲(chóng)MJGX2為對(duì)照。電泳時(shí)前1h電壓為80V,其后保持恒壓200V,整個(gè)電泳約4h。酯酶(EST)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)的染色配方及操作步驟參照Esbenshade等方法,顯色完全后漂洗3次,在10%醋酸加上10%甘油中固定3h以上,然后掃描并貯存在電腦中。參照Esbenshade等的標(biāo)準(zhǔn),判讀EST和MDH譜型,確定根結(jié)線蟲(chóng)的種類(lèi)。1.3提取和檢測(cè)數(shù)據(jù)1.3.1相關(guān)dna的提取參照美國(guó)Williamson和Liuqingli(個(gè)人通信)所介紹的方法稍作修改。步驟如下:取每種根結(jié)線蟲(chóng)從卵塊孵化而來(lái)的2齡幼蟲(chóng)10～20μL的線蟲(chóng)沉淀塊,用鑷子將此管及一錐形研磨棒投入液氮中,30s后,用力研磨成粉末,加入700μL提取緩沖液(50mmol/LTris-HCl、pH7.5,50mmol/LNaCl,5mmol/LEDTA、pH8.0,0.5%SDS)和7μL的20mg/mL蛋白酶K輕輕混勻;將管放入50℃水浴4～5h;接著分別用等體積的Tris飽和酚和氯仿/異戊醇各抽提1次;而后加入0.1倍體積的3mol/L醋酸鈉(pH5.2)和2.5倍體積經(jīng)預(yù)冷的無(wú)水乙醇沉淀DNA;最后將沉淀的DNA溶解于40μLTE中(10mmol/LTris-HCl、pH8.0,0.1mmol/LEDTA)。取1μLDNA樣品在0.8%的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mLEB)中電泳分離,以檢測(cè)DNA的濃度。1.3.2單帶線蟲(chóng)dna提取參照張立海等方法進(jìn)行。1.4u2004pcr擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)所用引物為#C2F3(5′-GGTCAATGTCAG-AAATTTGTGG-3′)和#1108(5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′)。采用25μL反應(yīng)體積,反應(yīng)組分為:DNA模板為每反應(yīng)10～20ng;2.5μL10×PCR緩沖液;2.5μLMg2+;0.5μLdNTP(每一核苷酸為10μmol/L);0.5μL引物#C2F3;0.5μL引物#1108;ddH2O至25μL;0.2μLTaq酶(上海生工)。擴(kuò)增反應(yīng)在PE9700-PCR儀上進(jìn)行,擴(kuò)增程序?yàn)?94℃預(yù)變性4min;94℃變性1min,50℃退火1min,70℃延伸1min,進(jìn)行35個(gè)循環(huán);最后72℃保溫5min。當(dāng)模板為單條2齡幼蟲(chóng)DNA提取物時(shí),PCR的循環(huán)數(shù)為40個(gè),其它條件不變。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%(含0.5μg/mLEB)中電泳分離,電泳緩沖液為0.5×TBE,電壓為80V,電泳約30min,在凝膠圖像分析系統(tǒng)上照像和保存。1.5pcr反應(yīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性?xún)?nèi)切酶HinfⅠ(大連寶生物)酶切。反應(yīng)體系包括5μL擴(kuò)增產(chǎn)物,2μL10×PCR反應(yīng)緩沖液,1μL內(nèi)切酶(10U/μL),12μLddH2O。37℃水浴4～6h。酶切產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mLEB)中電泳,電泳緩沖液為0.5×TBE,電壓為130V,電泳約50min,在凝膠圖像分析系統(tǒng)上照像和保存。2結(jié)果與分析2.1種同工酶表型用常規(guī)電泳技術(shù)分析了38個(gè)純化種群的酯酶(EST)和蘋(píng)果酸脫氫酶(MDH)。結(jié)果顯示EST酶譜有I1、J3和A2三種表型;MDH酶譜均為N1表型。參照Esbenshade等的標(biāo)準(zhǔn),2種同工酶表型分別是I1和N1的種群是南方根結(jié)線蟲(chóng),共29個(gè)種群;表型分別是J3和N1的種群是爪哇根結(jié)線蟲(chóng),共6個(gè)種群;表型分別是A2和N1的種群是花生根結(jié)線蟲(chóng),共3個(gè)種群。結(jié)果見(jiàn)表1。2.2pcr擴(kuò)增片段大小及根結(jié)線蟲(chóng)種群分子身份證編碼運(yùn)用引物#C2F3和#1108對(duì)42個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)種群mtDNA的COⅡ和LrRNA基因間序列擴(kuò)增。結(jié)果表明:35個(gè)種群的擴(kuò)增片段大小約為1.7kb,其中29個(gè)種群是南方根結(jié)線蟲(chóng),6個(gè)種群是爪哇根結(jié)線蟲(chóng);3個(gè)花生根結(jié)線蟲(chóng)種群的擴(kuò)增片段大小約為1.1kb;3個(gè)北方根結(jié)線蟲(chóng)種群的擴(kuò)增片段大小約為0.5kb;1個(gè)種群的擴(kuò)增片段大小約為0.7kb,為根結(jié)線蟲(chóng)屬在中國(guó)的新記錄種(另文發(fā)表)。用單條2齡幼蟲(chóng)提取物作模板得到的結(jié)果與大量提取DNA作模板的結(jié)果相同(部分結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2)。2.3南方根結(jié)線蟲(chóng)不能對(duì)花真線蟲(chóng)酶切鑒定為了區(qū)分產(chǎn)生相同大小片段的南方根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng),用限制性?xún)?nèi)切酶HinfⅠ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。結(jié)果表明:所有供試的南方根結(jié)線蟲(chóng)都可以被HinfⅠ酶切,且產(chǎn)生約1.3和0.4kb的2個(gè)限制性片段;供試的爪哇根結(jié)線蟲(chóng)種群不能被酶切。另外,研究發(fā)現(xiàn)HinfⅠ也不能對(duì)花生根結(jié)線蟲(chóng)、北方根結(jié)線蟲(chóng)及Gx8的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。研究中我們用單條根結(jié)線蟲(chóng)2齡幼蟲(chóng)提取物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果與大量提取線粒體DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切結(jié)果一致。部分酶切結(jié)果見(jiàn)圖3。3種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)的pcr擴(kuò)增特性同工酶表型特征是根結(jié)線蟲(chóng)鑒定的一個(gè)重要分類(lèi)依據(jù)。研究表明:根據(jù)Esbenshade等建立的鑒定幾種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)的酯酶和蘋(píng)果酸脫氫酶表型標(biāo)準(zhǔn),對(duì)常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)種的鑒定是非常準(zhǔn)確和有效的,可以用于根結(jié)線蟲(chóng)病害的田間診斷。本研究分析的38個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)種群都具有典型的同工酶表型,與國(guó)內(nèi)外的報(bào)道一致,這進(jìn)一步證實(shí)了它在分類(lèi)鑒定上的價(jià)值。但同工酶分析需要年輕雌蟲(chóng),而田間根結(jié)線蟲(chóng)最通常的蟲(chóng)態(tài)卻是2齡幼蟲(chóng),所以這一方法對(duì)田間診斷有一定局限性。以DNA為基礎(chǔ)的分子診斷,可以克服不同蟲(chóng)態(tài)和發(fā)育階段的影響,為線蟲(chóng)的準(zhǔn)確、快速鑒定提供有效的途徑。本研究通過(guò)對(duì)供試種群的mtDNA的COⅡ和LrRNA基因間序列的PCR擴(kuò)增,并結(jié)合限制性?xún)?nèi)切酶的HinfⅠ酶切,成功地鑒定了4種常見(jiàn)的根結(jié)線蟲(chóng)。在本實(shí)驗(yàn)條件下,花生根結(jié)線蟲(chóng)和北方根結(jié)線蟲(chóng)分別擴(kuò)增了1.1和0.5kb片段的產(chǎn)物;南方根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根線蟲(chóng)均擴(kuò)增了1.7kb片段的產(chǎn)物。后2種線蟲(chóng)可以通過(guò)HinfⅠ酶切反應(yīng)來(lái)加以區(qū)別。值得注意的是,幾種mtDNA的COⅡ和LrRNA基因間序列的PCR擴(kuò)增片段大小有一定的變異性。根據(jù)花生根結(jié)線蟲(chóng)和南方根結(jié)線蟲(chóng)mtDNA的研究資料,本研究結(jié)果與Powers等和Williamson等基本一致,但與Orui和Blok等存在一定差異。對(duì)花生根結(jié)線蟲(chóng)而言,Orui對(duì)酯酶同工酶表型為A1和A2的花生根結(jié)線蟲(chóng)mtDNA擴(kuò)增時(shí),均得到約為1.7kb大小的相同片段;Blok等擴(kuò)增到1.1和1.7kb兩個(gè)不同的片段;對(duì)南方根結(jié)線蟲(chóng)mtDNA而言,Blok等在其研究中發(fā)現(xiàn)有1個(gè)種群產(chǎn)生約1.45kb大小的片段。本研究mtDNA擴(kuò)增產(chǎn)物的HinfⅠ酶切反應(yīng)表明,所有供試南方根結(jié)線蟲(chóng)的種群能夠被酶切,并產(chǎn)生約1.3和0.4kb的2個(gè)片段,爪哇根結(jié)線蟲(chóng)的擴(kuò)增產(chǎn)物不能被HinfⅠ酶切,這與Williamson等和Orui報(bào)道的酶切表型一致,但與Powers等的結(jié)果存在差異,后者報(bào)道的南方根結(jié)線蟲(chóng)擴(kuò)增產(chǎn)物被酶切產(chǎn)生約1.0、0.4和0.3kb的3個(gè)片段,爪哇根結(jié)線蟲(chóng)種群的擴(kuò)增產(chǎn)物被酶切產(chǎn)生約1.0和0.7kb的2個(gè)限制性片段。Xu等分析了來(lái)自中國(guó)14個(gè)省的46個(gè)根結(jié)線蟲(chóng)種群mtDNA擴(kuò)增產(chǎn)物限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,他所用的引物是#C2F3和MRH106,后面引物位點(diǎn)比引物#1108的位點(diǎn)要更接近ND3,擴(kuò)增出來(lái)的產(chǎn)物片段比本研究的長(zhǎng)100bp左右。但從他的報(bào)道和本研究結(jié)果來(lái)分析,3種常見(jiàn)根結(jié)線蟲(chóng)在mtDNA的CO