蓖麻提取物對(duì)南方根結(jié)線蟲病的殺線活性及防治研究

蓖麻提取物對(duì)南方根結(jié)線蟲病的殺線活性及防治研究

根結(jié)線蟲是一個(gè)重要的植物致病性因素，其寄生范圍廣泛，包括谷物、油出版物、纖維、蔬菜、材料和花卉。根結(jié)線蟲通常會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。通常有四種類型：南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、水生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲。根結(jié)線蟲在中國(guó)南方的廣泛出現(xiàn)，嚴(yán)重影響了蔬菜生產(chǎn)。目前，化學(xué)預(yù)防仍然是控制植物寄生昆蟲疾病最重要的措施。然而，化學(xué)品具有毒性高、殘留高、成本高、易污染環(huán)境、環(huán)境相容性差等問題。天然寄生蟲植物具有快速分解、低殘留、少污染、少毒性等特點(diǎn)。因此，植物起源活性物質(zhì)的利用將引起人們的注意。蓖麻(Ricinuscommunus)屬大戟科蓖麻屬,為雙子葉一年生或多年生植物.蓖麻是具有特殊工業(yè)用途的油料植物,是集多種開發(fā)功能于一體的生物資源,也是一種重要的生物殺蟲、抗癌和生物抗污染源.從蓖麻中提取的蓖麻毒素具有較強(qiáng)的殺蟲、殺菌作用,是制造生物農(nóng)藥的重要來源.本文以南方根結(jié)線蟲為研究對(duì)象,通過毒力測(cè)定及盆栽試驗(yàn)研究了蓖麻提取物的殺線蟲活性及防治效果,以期為該病害的生物防治提供參考.1材料和方法1.1供試植株及試劑毒力測(cè)試于2010年4—7月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行,盆栽試驗(yàn)于2010年8—10月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)土壤生態(tài)實(shí)驗(yàn)室溫室大棚進(jìn)行.供試蓖麻葉于2009年9月采自山東家祥蓖麻研究所.供試番茄(Lycopersiconesculentum)品種為蘇粉八號(hào),由江蘇省江蔬種苗科技有限公司生產(chǎn).供試線蟲經(jīng)鑒定為南方根結(jié)線蟲.1.2人工繁殖培養(yǎng)在江蘇省宜興市固體有機(jī)廢棄物資源化高技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室周邊根結(jié)線蟲危害嚴(yán)重的農(nóng)田采集土樣,接種至番茄苗上進(jìn)行人工繁殖.從感染根結(jié)線蟲的番茄病根挑取新鮮卵囊,置于培養(yǎng)皿(d=6cm),皿底墊濕潤(rùn)濾紙1張,置于(25±1)℃培養(yǎng)箱,5~7d后待卵孵化產(chǎn)生大量2齡幼蟲時(shí),收集線蟲備用.取病根于解剖鏡下挑取大小一致的卵囊,用1%的次氯酸鈉表面消毒3~4min,無菌水漂洗4~5次,備用.1.3l-1析水提物的制備供試蓖麻先采用微波提取法粗提.然后粗提物采用索氏提取法精提.得到精提物為白色針狀結(jié)晶.該精提物經(jīng)核磁共振1H譜結(jié)構(gòu)確定為蓖麻堿(ricinine),測(cè)其純度為89.1%.稱取已滅菌的蓖麻葉干粉5g,加無菌水50mL,于30℃振蕩浸提24h,1000×g低速離心2min,用無菌濾紙過濾,濾液用無菌水定容至50mL,制成100g·L-1蓖麻水提液.1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.4.1和0.25gl-13參考翁群芳等浸漬法測(cè)定提取物對(duì)二齡幼蟲的毒力.根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果,用滅菌水將制備的蓖麻堿溶解稀釋成5個(gè)濃度梯度:2、1.5、1、0.5和0.25g·L-1;蓖麻水提液稀釋成5個(gè)濃度梯度:100、50、25、12.5和6.25g·L-1.分別量取3mL稀釋液加入d=2.5cm的培養(yǎng)皿(12孔板)中,隨后加入50~100條線蟲,每處理4個(gè)重復(fù),以滅菌水為對(duì)照,放置于25℃培養(yǎng)箱中,48h后用針觸法鏡檢線蟲死亡數(shù)量.按Abbott公式計(jì)算校正死亡率,根據(jù)濃度對(duì)數(shù)和死亡機(jī)率值,采用最小二乘法求取毒力回歸方程,計(jì)算LC50.1.4.2評(píng)論員ld50在每個(gè)培養(yǎng)皿(d=6cm)中放入2個(gè)制備好的南方根結(jié)線蟲的卵囊,處理分別加4mL蓖麻堿稀釋液(1g·L-1)和4mL蓖麻水提液(25g·L-1),對(duì)照加4mL滅菌水.處理和對(duì)照各4次重復(fù).置于25℃培養(yǎng)箱中,分別在2、6、10和14d于解剖鏡下觀察卵孵化數(shù),并計(jì)算蓖麻堿和水提液對(duì)卵囊孵化的抑制率.1.4.3植物源農(nóng)藥對(duì)照利用根據(jù)對(duì)二齡幼蟲的毒力測(cè)定結(jié)果,以蓖麻堿稀釋液1g·L-1、蓖麻水提液25g·L-1、滅菌蓖麻葉植物粉(與干沙土以1∶150施用)分別為處理組,以滅菌水為溶劑對(duì)照,并設(shè)0.36%苦參堿水劑(山西省侯馬市星火化工廠生產(chǎn))稀釋1000倍為植物源農(nóng)藥對(duì)照,辛硫磷(上海愛幫農(nóng)科技有限公司生產(chǎn))與干沙土以1∶150施用為常規(guī)化學(xué)農(nóng)藥對(duì)照.采用滅菌土栽培法,將出苗30d后的番茄植株幼苗移栽至裝有滅菌土(沙、土比為1∶1)的直徑為9cm的塑料杯中,每盆1株,每處理5個(gè)重復(fù),置于25℃溫室內(nèi)生長(zhǎng).定植后5d的番茄植株分別接種1000條南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲.6d后分別以蓖麻堿稀釋液、蓖麻水提液、滅菌水、苦參堿各6mL灌根,以滅菌蓖麻葉植物粉、辛硫磷各1.4g穴施,正常水肥管理,20d后調(diào)查試驗(yàn)結(jié)果.1.5地上部植株鮮質(zhì)量常規(guī)指標(biāo):挖取各處理番茄植株,洗凈抹干,將番茄植株平鋪,量地上部植株高度及地下部根長(zhǎng)度,用電子天平準(zhǔn)確稱量地上部植株鮮質(zhì)量.以對(duì)照為標(biāo)準(zhǔn),分別計(jì)算:地上部植株株高增長(zhǎng)率、地上部植株鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率、根長(zhǎng)增長(zhǎng)率.統(tǒng)計(jì)每株根結(jié)數(shù),計(jì)算根結(jié)指數(shù)(GI)和根結(jié)形成抑制率.生化指標(biāo):采用α-萘胺法測(cè)定根系活力;采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測(cè)定葉片的超氧化物歧化酶(SOD)活性,紫外吸收法測(cè)定過氧化氫酶(CAT)活性.1.6數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析Duncan多重比較方差分析,顯著性水平設(shè)為0.05.圖表中數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.采用Excel2003軟件制圖.2結(jié)果與分析2.1監(jiān)測(cè)站.4-4-5gl-1和5.毒力測(cè)定顯示,不同濃度蓖麻堿對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲均有毒殺效果(表1),其毒力回歸方程、LC50分別為y=2.1017x-0.8161和0.6g·L-1.隨著處理濃度的提高其毒殺效果隨之增強(qiáng).濃度為2和1.5g·L-1的處理,線蟲校正死亡率分別達(dá)到91.5%和79.4%,均顯著高于其他3個(gè)處理.濃度為1g·L-1時(shí),校正死亡率為60.1%,且隨著濃度的降低毒殺效果顯著降低.不同濃度蓖麻水提液對(duì)南方根結(jié)線蟲二齡幼蟲的毒殺效果不同(表1),其毒力回歸方程、LC50分別為y=1.1412x+3.5588和18.3g·L-1.隨著處理濃度的提高其毒殺效果隨之增強(qiáng).濃度為100和50g·L-1的處理,線蟲校正死亡率分別為83.5%和64.8%,均顯著高于其他3個(gè)處理,濃度為25g·L-1時(shí),校正死亡率為52.4%.2.2東南角硅水提液與社會(huì)主義堿處理的抑制作用經(jīng)過2、6、10和14d的觀察發(fā)現(xiàn),所有蓖麻堿和蓖麻水提液的處理對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化都有抑制作用(表2).14d時(shí)蓖麻堿抑制作用最明顯,抑制率高達(dá)61.7%,顯著高于蓖麻水提液(49.0%).蓖麻堿和蓖麻水提液處理均在2d時(shí)就表現(xiàn)出抑制作用,6d時(shí)抑制率出現(xiàn)小幅度下降,10~14d時(shí)抑制率出現(xiàn)上升趨勢(shì)并最終達(dá)到最大值.6d時(shí)抑制率下降的原因可能是線蟲的孵化速率減慢.10~14d抑制率上升可能是由于處理液作用時(shí)間較長(zhǎng),導(dǎo)致孵化出的線蟲在一定程度上發(fā)生死亡分解.2.3提取物對(duì)番茄生長(zhǎng)和根結(jié)的影響2.3.1苦參堿和辛硫磷對(duì)南方根結(jié)線蟲生長(zhǎng)指標(biāo)影響由表3可知,蓖麻提取物對(duì)番茄株高、地上部鮮質(zhì)量及根長(zhǎng)的影響相似,均有促進(jìn)增長(zhǎng)作用.其中,蓖麻堿處理的番茄株高、地上部鮮質(zhì)量及根長(zhǎng)的增長(zhǎng)率顯著大于其他處理.蓖麻堿、蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉處理的番茄株高分別比對(duì)照增長(zhǎng)33.5%、22.6%和15.8%,與對(duì)照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的增長(zhǎng)率10.2%和12.3%相比差異顯著.蓖麻堿和蓖麻水提液處理的番茄地上部鮮質(zhì)量分別比對(duì)照增長(zhǎng)41.4%和18.9%,與對(duì)照藥劑苦參堿和辛硫磷相比差異顯著.蓖麻葉植物粉處理的番茄鮮質(zhì)量增長(zhǎng)率為10.1%,與對(duì)照藥劑差異不顯著.蓖麻堿、蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉處理的番茄根長(zhǎng)分別比對(duì)照增長(zhǎng)46.8%、34.5%和33.8%,與對(duì)照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的增長(zhǎng)率24.5%和28.1%相比差異顯著.線蟲為害寄主植物時(shí)能分泌特殊物質(zhì)造成植株形成根結(jié)、腫瘤和蟲癭,導(dǎo)致寄主植物發(fā)育停滯,矮化或葉片變薄、變黃等.以上試驗(yàn)結(jié)果表明,蓖麻提取物3種處理對(duì)南方根結(jié)線蟲有一定的抑制作用,在很大程度上能促進(jìn)植株的生長(zhǎng).2.3.2根結(jié)數(shù)及根結(jié)指數(shù)表3顯示,番茄根結(jié)數(shù)直觀地反映了蓖麻提取物對(duì)南方根結(jié)線蟲的控制效果,對(duì)照每株根結(jié)數(shù)多達(dá)(37.4±2.3)個(gè),蓖麻提取物各處理植株根結(jié)數(shù)均顯著低于對(duì)照.其中,蓖麻堿處理后根結(jié)數(shù)最少,僅為每株(17.6±1.7)個(gè),與對(duì)照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的每株根結(jié)數(shù)(25.6±3.4)和(27.4±3.9)個(gè)相比差異顯著;其次為蓖麻水提液、蓖麻葉植物粉處理,根結(jié)數(shù)分別為每株(20.6±1.5)和(22.8±3.7)個(gè),與對(duì)照相比差異顯著.蓖麻堿、蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉處理的番茄根結(jié)形成抑制率分別比對(duì)照增長(zhǎng)52.9%、44.9%和39.0%,與對(duì)照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的根結(jié)形成抑制率31.6%和26.7%相比差異顯著.其中,蓖麻堿處理的根結(jié)形成抑制率顯著大于其他處理.根結(jié)指數(shù)可作為作物對(duì)根結(jié)線蟲的抗性及殺線劑藥效的評(píng)價(jià)指標(biāo).蓖麻堿處理后根結(jié)指數(shù)最低,僅為(24.5±5.4),與對(duì)照藥劑苦參堿和辛硫磷處理的(45.1±12.1)和(51.0±14.4)相比差異顯著,且顯著低于溶劑對(duì)照的(72.4±18.4).說明蓖麻堿處理的植株對(duì)根結(jié)線蟲抗性最大,蓖麻堿的殺線作用最強(qiáng).蓖麻堿處理與蓖麻水提液及蓖麻葉植物粉處理的(34.1±18.7)和(38.0±5.9)相比差異顯著,蓖麻水提液與蓖麻葉植物粉處理之間差異不顯著,但均顯著低于對(duì)照.番茄根結(jié)數(shù)、根結(jié)形成抑制率及根結(jié)指數(shù)均能客觀反映蓖麻提取物對(duì)南方根結(jié)線蟲的控制效果.以上試驗(yàn)結(jié)果說明,蓖麻提取物能抑制根結(jié)形成,減少植株根結(jié)數(shù),防治效果優(yōu)于商品殺蟲劑(苦參堿、辛硫磷).2.3.3根結(jié)線蟲對(duì)根系活力的影響由圖1可知,不同處理對(duì)番茄植株根系活力的影響不同,蓖麻堿處理的番茄植株根系活力最大,達(dá)到121.6μg·g-1·h-1,遠(yuǎn)大于對(duì)照的79.9μg·g-1·h-1,其處理效果最佳,最適合番茄植株根系的生長(zhǎng)發(fā)育.蓖麻水提液與苦參堿處理、蓖麻葉植物粉與辛硫磷處理的根系活力差異不顯著,處理效果接近,但均高于對(duì)照.根系活力反映植物根系吸收與代謝能力的強(qiáng)弱,直接影響植株的抗逆性及地上部莖葉的生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量.由于蓖麻堿處理的根系活力最大,說明該處理下根結(jié)線蟲對(duì)根系的影響最小,其防治效果最好.而對(duì)照的根系活力最小,說明該處理下根系對(duì)根結(jié)線蟲的抗性最弱,根結(jié)線蟲對(duì)根系的影響最大.由圖2可知,不同處理對(duì)番茄植株葉片SOD酶和CAT酶活性的變化趨勢(shì)相似,處理與對(duì)照之間總體呈升高趨勢(shì).由于在逆境條件下植物會(huì)增加活性氧自由基的清除能力,所以其體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)等保護(hù)酶會(huì)增加,以減輕活性氧對(duì)植物的傷害.而對(duì)照處理葉片SOD酶活性最大,達(dá)到196.5U·g-1,說明在線蟲侵染的狀態(tài)下,植株體內(nèi)SOD酶增加,以對(duì)抗線蟲侵染下活性氧的增加.蓖麻堿處理的葉片SOD酶活性相對(duì)最小,達(dá)到191.5U·g-1,說明蓖麻堿處理中根結(jié)線蟲對(duì)植株的影響最小,植株受害程度最小.其余各處理的葉片SOD酶活性差異不顯著,處理效果接近,均低于對(duì)照處理,這說明植株受害程度均比對(duì)照處理弱.番茄植株葉片CAT酶活性在對(duì)照處理達(dá)到最大值21.0U·g-1·min-1,蓖麻堿處理為最小值15.0U·g-1·min-1,其他處理CAT酶活性相近,變化幅度較小,差異不顯著,但均低于對(duì)照處理.該試驗(yàn)中CAT酶在葉片中的活性及含量相對(duì)SOD酶弱,但其作用與SOD酶相似,也能間接指示植株在逆境下的抗性及受害程度.3類植物改革劑對(duì)南方根結(jié)線蟲的防治南方根結(jié)線蟲作為重要的植物害蟲,國(guó)內(nèi)外均非常重視尋找合適的高效控制方法,其中印楝(Azadirachtaindica)、烏桕(Sapiumsebiferum)、檸檬桉(Eucalyptuscitriodora)、胡黃連(Picrorhizascrophulariiflora)、魚腥草(Houttuyniacordata)和夾竹桃(Neriumindicum)等植物源物質(zhì)對(duì)其均有較好的控制作用.有報(bào)道,蓖麻堿對(duì)天幕毛蟲(Malacosomneustriatestacea)、桃蚜(Myzuspersicae)、小菜蛾(Plutellaxyllostella)等3種害蟲有不同程度的殺滅作用,蓖麻葉粉碎與肥料混施可以減少根瘤,有效控制根結(jié)線蟲二齡幼蟲.本試驗(yàn)結(jié)果表明,蓖麻堿、蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉3種物質(zhì)均對(duì)南方根結(jié)線蟲具有強(qiáng)烈或較強(qiáng)的毒殺活性,而且能顯著促進(jìn)盆栽番茄地上部植株高度、鮮質(zhì)量和根長(zhǎng)生長(zhǎng),顯著降低番茄根結(jié)數(shù),降低根結(jié)指數(shù),對(duì)根結(jié)形成具有較強(qiáng)的抑制效果,盆栽控制效果良好.根系活力反映植物根系吸收與代謝能力的強(qiáng)弱,直接影響植株的抗逆性及地上部莖葉的生長(zhǎng)和作物產(chǎn)量,本試驗(yàn)通過對(duì)根系活力的測(cè)定可以間接反映不同處理對(duì)根結(jié)線蟲的防治效果.同樣,對(duì)SOD和CAT兩種抗氧化酶的測(cè)定可以間接反映在逆境條件下植物的受害情況.苦參堿和辛硫磷是目前農(nóng)藥市場(chǎng)上常用的兩種殺線劑.試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與同稀釋濃度的苦參堿、辛硫磷相比,蓖麻堿對(duì)降低寄主植物根結(jié)數(shù)的作用效果更優(yōu),而蓖麻水提液和蓖麻葉植物粉處理與兩種農(nóng)藥的作用效果接近.蓖麻精提物的化學(xué)成份為蓖麻堿,其化學(xué)名稱為3-氰基-4-甲氧基-1-甲基-2-吡啶酮,是一種中性生物堿.其分子中含氰基,所以毒