糖尿病腎病大鼠腎臟和肺臟水通道蛋白-2、肺臟水通道蛋白-1的表達(dá)

糖尿病腎病大鼠腎臟和肺臟水通道蛋白-2、肺臟水通道蛋白-1的表達(dá)

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者死亡的主要原因之一。已往對(duì)DM腎、肺的微血管并發(fā)癥研究相對(duì)較少。實(shí)驗(yàn)觀察,水液代謝紊亂是DM肺、腎損傷的一個(gè)獨(dú)立的因素;研究表明,水通道蛋白家族(AQPs)在DM及其微血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展中起重要作用。本研究觀察DM腎、肺組織微血管的病理學(xué)改變,及其水通道蛋白-2(AQP2)、水通道蛋白-1(AQP1)表達(dá)及丹參干預(yù)AQP2、AQP1的效應(yīng)變化,旨在探討AQP2、AQP1的表達(dá)改變與糖尿病腎病水液代謝異常的關(guān)系以及丹參的藥理效應(yīng),為DN的預(yù)防和提供依據(jù)。1材料和機(jī)器1.1動(dòng)物1.2藥物和試劑1.3儀器2方法2.1動(dòng)物組和糖尿病模型的構(gòu)建和藥物2.2細(xì)胞法檢測(cè)rabcisanti-aqp2的表達(dá)腎組織免疫組織化學(xué)染色(試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)。按試劑盒操作步驟進(jìn)行加樣,以SABC法進(jìn)行檢測(cè)。一抗為Rabbitanti-AQP2。細(xì)胞漿中呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng),圖像采用Miaspro圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。所有切片放大倍數(shù)為1000×。每組取6只動(dòng)物,每只動(dòng)物AQP2染色各取2張切片,觀察3個(gè)視野。視場(chǎng)面積為480000mm2,測(cè)定陽(yáng)性面積比[Aa(%)](陽(yáng)性面積/視野面積)。2.5統(tǒng)計(jì)處理3結(jié)果3.1各組動(dòng)物的一般情況3.2各組動(dòng)物腎組織病理學(xué)改變3.3肺組織的病理改變3.4腎組織3.5肺組織4降血糖對(duì)大鼠肝腎功能的影響AQP的發(fā)現(xiàn)為糖尿病腎病水代謝的異常提供了新的研究角度。肺泡腔和血管腔間水的快速轉(zhuǎn)運(yùn)有極其重要的生理功能。肺泡內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)主要有兩條途徑:一是伴隨鈉的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn);二是經(jīng)肺泡上皮上的AQPs。AQP1主要表達(dá)于肺泡周圍的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞,調(diào)節(jié)肺內(nèi)毛細(xì)血管與肺泡間水通透性。具體機(jī)制:(1)通道管的空間尺寸限制了比水分子大的小分子的通過;(2)通道管的溶質(zhì)結(jié)合位置分布使水分子得以順利通過;(3)通道管有限度的親水環(huán)境阻礙水溶液中離子的通過。有資料顯示AQP1基因敲除小鼠與野生型相比,肺滲透壓依賴的被動(dòng)性水轉(zhuǎn)運(yùn)被抑制90%。尿液濃縮稀釋功能由腎臟集合管主細(xì)胞的AQP2來完成,而AQP2的表達(dá)主要受加壓素(anti-diuretichormonevasopressin,AVP)的調(diào)節(jié)。AVP與腎組織集合管主細(xì)胞基底膜上的AVPV2受體結(jié)合后,使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度升高,激活PKA,將AQP2蛋白磷酸化,使之從囊泡穿梭到管腔膜,從而提高集合管對(duì)水的通透性,同時(shí)該信號(hào)通路激活CREB元件,刺激AQP2的合成,表現(xiàn)為AQP2mRNA和蛋白水平的提高,從而實(shí)現(xiàn)AVP的抗利尿作用。既往研究表明在DM大鼠中血AVP水平升高,這可能與水鈉潴留有關(guān),而AVP升高除了受非滲透性因素的影響外,血漿晶體滲透壓的相對(duì)升高也是促進(jìn)下丘腦合成和分泌AVP的因素之一。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺腎之間在水液代謝方面關(guān)系密切。在生理情況下,肺主氣,體內(nèi)的水液經(jīng)過肺氣的宣肅,才能輸布到全身各臟腑組織器官,并下達(dá)到膀胱,所以,肺被稱作“水之上源”。若肺的通調(diào)水道功能減退,就可發(fā)生水液停聚而生痰、成飲,甚則水腫,無(wú)汗等病變。腎為水臟,職司氣化,水夜的升降開合,全要靠腎的氣化作用。肺腎合作,才能保證水液代謝正常的完成,兩者中,腎又占主要地位,故《素問·水熱穴論》說:“其本在腎,其未在肺”。在病理方面:肺失宣肅,通調(diào)水道的功能失調(diào),能累及到腎,出現(xiàn)小便不利,甚至水腫;腎虛水無(wú)所主,逆而上泛,又會(huì)見到喘咳氣急,不得平臥。祖國(guó)醫(yī)學(xué)所認(rèn)識(shí)的消渴,日久則出現(xiàn)的“水腫”“脹滿”“尿濁”“關(guān)格”與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的糖尿病腎病的臨床癥狀相似?！督饏T要略》有記載“血不利則為水”,丹參可以通過擴(kuò)張血管、加快血液流速,從而消除血液淤滯改善微循環(huán),因此“血行則水行”,局部的水腫狀態(tài)得以改善。丹參之脂溶性成分丹參酮,水溶性成分丹參素、原兒茶醛、丹參酚酸B,研究證實(shí)丹參增加腎血流、有利尿和抗炎作用,可降低血BUN、Scr,調(diào)節(jié)腎組織局部微循環(huán),改善腎功能。本研究結(jié)果表明丹參能顯著降低糖尿病大鼠24h尿蛋白排泄率、血糖,改善“三多一少”癥狀。而單純用降糖藥物(格列吡嗪)僅能降低血糖,但對(duì)改善DN狀態(tài)下的腎臟血流動(dòng)力學(xué)效果不佳。丹參不僅可降低血糖而且還能全面調(diào)理DN狀態(tài)時(shí)的血液流變學(xué)情況,延緩腎小球硬化的發(fā)生,減少細(xì)胞外基質(zhì),從而對(duì)糖尿病腎病起到保護(hù)的作用。同時(shí)我們又發(fā)現(xiàn)用丹參治療能顯著降低糖尿病大鼠腎組織中的AQP2蛋白表達(dá),提高AQP1在肺臟的表達(dá),因此我們推測(cè)丹參對(duì)糖尿病大鼠腎臟的保護(hù)作用可能與降低AQP2,導(dǎo)致AQP2在腎臟集合管重新分布有關(guān),升高AQP1的表達(dá)改變微血管通透性,以減輕DM病變臟器的水腫病理狀態(tài)。本研究從蛋白水平探討了中醫(yī)的肺腎同治理論,有關(guān)丹參改善水液代謝作用機(jī)理與水通道蛋白的關(guān)系,有待進(jìn)一步深入研究。選用4周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠[第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(軍)2002-005]60只,體質(zhì)量為(165±12.5)g。SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境,環(huán)境溫度為20~25℃,12/12h晝夜規(guī)律,按每籠5只喂養(yǎng)。格列吡嗪片(5mg/片),海南贊邦制藥有限公司,批號(hào)051207;丹參(西京醫(yī)院藥劑科中藥制劑室煎制):按成人劑量的10倍,水煎濃縮至稠膏每克含生藥5.1g,按5.5g/kg(體質(zhì)量),1次/d,灌胃,4℃冰箱貯藏備用。鏈脲佐菌素(Strep-美國(guó)公司)。GeneAMPPCRsystem2400(AppliedBiosystems);微量血糖測(cè)定儀,美國(guó)羅氏公司生產(chǎn);UV-2501PC型分光光度計(jì),日本島津儀器廠生產(chǎn);Miaspro圖像分析系統(tǒng)。2.4動(dòng)物分組、治療組及高糖高糖模型的建立與管理隨機(jī)將大鼠分為兩組:正常組10只;糖尿病造模組(DM)50只;正常組進(jìn)食普通飼料。糖尿病造模組進(jìn)食高糖高脂飼料,即普通飼料中加入10%的豬油、10%的葡萄糖、1%的膽固醇、2%的蛋黃粉、0.2%的膽酸鈉。糖尿病模型組大鼠在高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周后尾靜脈注射低劑量STZ(30mg/kg)1次。以注射后1個(gè)月血糖值持續(xù)高于7.8mmol/L,尿糖陽(yáng)性者為DM模型建立成功(成模率為60%),共選出糖尿病動(dòng)物30只,隨機(jī)分到模型組,對(duì)照組和觀察組3個(gè)組中,每組10只。該模型具有中度高血糖、高血脂、胰島素抵抗以及典型的糖尿病腎病改變等特點(diǎn)。對(duì)照組:每日灌服格列吡嗪5mg/(kg·d),觀察組:每日灌服丹參5.5g/(kg·d)。正常組和模型組灌服等體積的蒸餾水。實(shí)驗(yàn)期間,所有動(dòng)物在同一條件下,室溫保持在20~24℃,相對(duì)濕度40%。正常組動(dòng)物自由飲水,標(biāo)準(zhǔn)飲食,模型組、治療組、觀察組動(dòng)物給予高糖高脂飲食,自由飲水。至第16周末,用25%烏拉坦麻醉大鼠,打開腹腔,從腹主動(dòng)脈取血,充分暴露兩側(cè)腎臟,將分離的腎臟迅速放入4%多聚甲醛中固定,用于石蠟切片。開胸充分暴露手術(shù)視野,分離肺組織,將肺組織迅速放入裝有4%甲醛的瓶中固定右肺中、下葉做病理學(xué)觀察,左肺做免疫組化染色。2.3正常大鼠腎組織病理學(xué)觀察肺組織免疫組織化學(xué)染色(試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)。按試劑盒操作步驟進(jìn)行加樣,以SABC法進(jìn)行檢測(cè)。一抗為Rabbitanti-AQP1。肺泡間質(zhì)中微血管呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性,所有切片放大倍數(shù)為400倍每組隨機(jī)取6只動(dòng)物,每只動(dòng)物AQP1染色各取3張切片,各觀察3個(gè)視野,視野面積為480000mm2,免疫組化結(jié)果以單個(gè)視野下陽(yáng)性微血管數(shù)表示。SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,采用One-wayANOVA法進(jìn)行方差分析。兩兩比較時(shí)根據(jù)其方差是否齊性選擇LSD或DunnettC方法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。正常組大鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng),皮毛光澤,一般情況好;模型組大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿,早期體重不同程度的有所增加,8周后一般情況變差,體重下降,消瘦,毛發(fā)失去光澤,后期出現(xiàn)腹脹。對(duì)照組和觀察組動(dòng)物的一般情況較好,體重比較穩(wěn)定,“三多一少”癥狀較模型組明顯減輕,皮毛較為光澤,沒有觀察到腹脹。血糖和24h尿蛋白排泄率也較模型組明顯降低。結(jié)果見表1。正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰,腎小管上皮細(xì)胞排列整齊,基底膜完整,間質(zhì)中未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維組織增生;模型組腎小球明顯肥大,系膜區(qū)增寬,系膜細(xì)胞增生、基質(zhì)增多,血管壁增厚,球內(nèi)可見大量紅細(xì)胞淤積,腎小管上皮細(xì)胞彌漫性空泡狀變性、腫脹脫落,部分腎小管內(nèi)有蛋白管型淤積;對(duì)照組上皮細(xì)胞空泡狀變性呈片狀,腎小球內(nèi)可見紅細(xì)胞淤積的情況,腎小管偶見上皮細(xì)胞脫落,小管內(nèi)可見蛋白管型;觀察組上皮細(xì)胞空泡狀變性呈局灶狀,僅存在于腎被膜下,腎小球內(nèi)少見紅細(xì)胞淤積,腎小管未見上皮細(xì)胞脫落,小管內(nèi)少見蛋白管型。結(jié)果見圖1~4。正常組動(dòng)物肺體積適中,顏色淡紅,無(wú)充血現(xiàn)象;模型組動(dòng)物肺體積增大,滲出明顯,肺緣鈍圓,切面質(zhì)實(shí),包膜下有點(diǎn)、片狀出血;觀察組和對(duì)照組動(dòng)物較模型組上述病變減輕。鏡下觀察,正常組動(dòng)物肺組織肺泡無(wú)萎陷,肺泡壁無(wú)增厚,肺泡間隔無(wú)增寬,肺泡和肺間質(zhì)無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5);模型組動(dòng)物見肺泡腔縮小,肺泡數(shù)量增多,肺泡隔明顯增寬,成纖維細(xì)胞數(shù)量增加,毛細(xì)血管基底膜增厚,血管擴(kuò)張淤血,腔內(nèi)充滿紅細(xì)胞,有較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖6);觀察組和對(duì)照組動(dòng)物肺組織上述改變減輕(見圖7~8)。AQP2的蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,AQP2蛋白在腎集合管表達(dá),而在腎小球和腎間質(zhì)未見表達(dá),與以往報(bào)道一致。模型組大鼠腎臟AQP2蛋白沿集合管內(nèi)壁上皮細(xì)胞分布的棕黃色顆粒比正常組明顯顏色加深而濃厚,分布面積更廣泛。上述結(jié)果說明模型組大鼠腎臟AQP2在蛋白水平上表達(dá)增強(qiáng);對(duì)照組和觀察組AQP2的棕黃色比模型組明顯色度減輕,面積減少(P<0.05)。見表1。QP1的蛋白表達(dá)肺組織中肺泡周圍和支氣管周AQP1