基于焦磷酸高通量測序的蠶豆發(fā)酵過程中細菌群落分析

基于焦磷酸高通量測序的蠶豆發(fā)酵過程中細菌群落分析

發(fā)酵食品是指用微生物加工而成的獨特味道和營養(yǎng)價值的食品，如炒煙、擠奶、泡菜、豆類等。其中豆豉是以大豆或黃豆為主要原料,經(jīng)由原料處理、制曲及后發(fā)酵三階段釀制而成,它不僅風味獨特,而且還富含多種生理活性物質(zhì),因此豆豉具有開胃增食、消積化滯、驅(qū)風散寒及預防心腦血管疾病等機能。豆豉品種繁多,根據(jù)發(fā)酵微生物的不同可以分為細菌型、曲霉型、毛霉型、根霉型和脈孢菌型等五大類。由于云南省獨特的地理位置、氣候條件和民族文化傳統(tǒng),生物資源繁多,細菌型豆豉中具有獨特和寶貴的菌種資源,由于缺乏對這些細菌全面的了解,這些寶貴的資源仍未得到很好的開發(fā)。在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中,通常采用富集純分離培養(yǎng)與鑒定方法對其中微生物群落結構進行研究,然而該方法不但操作繁瑣、費時費力,尤為重要的是在現(xiàn)有技術條件下,它僅能分離少數(shù)參與發(fā)酵的微生物,而大多數(shù)微生物得不到相應的分離培養(yǎng)與鑒定,通過純培養(yǎng)方法僅能得到傳統(tǒng)發(fā)酵樣品中微生物群落的極少部分信息,而不能真正反映傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物群落的真實信息,從而給充分發(fā)掘與利用發(fā)酵食品中的微生物資源帶來一定困難。李祥研究了參與細菌型豆豉發(fā)酵的細菌群落,發(fā)現(xiàn)主要有豆豉芽孢桿菌(Bacillusdouchi)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、乳酸桿菌(Lactobacillus)和微球菌(Micrococcus)?；?6SrRNA基因克隆文庫或變性梯度凝膠電泳(DGGE)能夠規(guī)避培養(yǎng)方法的弊端,使得對于樣品中的未培養(yǎng)細菌的分析成為可能。Chen等采用了PCR-DGGE的方法分析了豆豉中微生物群落結構,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)豆豉中都檢測到了枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、假單胞菌(Pseudomonas)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和粉狀畢赤酵母(Pichiafarinose),同時也檢測到了潛在的病原微生物如葡萄球菌(Staphylococcus)、泛菌(Pantoea)和腸桿菌(Enterobacter)等,暗示了在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中潛在致病菌存在的廣泛性,因此使用分子生物學方法對其進行檢測是極為必要的。隨著測序技術發(fā)展,被稱為“第二代測序(next-generationsequencing[NGS])”技術在過去幾年中不斷涌現(xiàn)與發(fā)展。第二代測序技術的共同特點是:高通量、低成本、可以同時對多個單獨的DNA分子進行測序分析?；赑yrosequencing測序法一次能夠測定100萬個長度達到400bp的核苷酸序列,其費用只相當于使用Sanger法測定幾千個序列的費用;由于該方法不需要克隆,可解決構建克隆文庫時所呈現(xiàn)的偏向性問題。2008年,Hamady等展示一種同時可以平行分析多個樣品的焦磷酸測序法。在對不同樣品進行PCR擴增時,在引物5′末端添加由8個堿基組成的標記(bar-code),應用這種方法,在同一次測序反應中可以同時分析1544個樣品。這一方法在多種類型樣品中的微生物多樣性及群落結構研究中得到極為廣泛應用。然而,該方法在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的應用還極為有限,僅有少數(shù)發(fā)酵食品使用該方法進行相應研究。作者通過高通量測序和序列分析,以期獲得云南細菌型豆豉中群落結構和多樣性,為進一步利用和開發(fā)豆豉中為細菌資源提供研究基礎,并為食品質(zhì)量和安全提供一定信息。1材料和方法1.1地百姓工具1.1.1樣品采集試驗用豆豉:購于云南省玉溪市易門縣菜市場,為當?shù)匕傩帐止ぶ谱?。購買后置于冰盒中運送到實驗室,-80℃保存。1.1.2主要緩沖液DNA提取裂解緩沖液:0.1mol/LTris/HCl,0.1mol/LEDTA,0.75mol/L蔗糖。1.2細菌16srrna和ccgctaatt-pcr檢測1.2.1DNA提取DNA提取參考Schmidt等的方法并做了部分改變,步驟如下:取約0.2g樣品置于無菌的2mL離心管中,加入450μL裂解緩沖液(0.1mol/LTris/HCl,0.1mol/LEDTA,0.75mol/L蔗糖),加入10μL、50mg/mL溶菌酶(lysozyme)和10μL、20mg/mL溶壁酶(lyticase),避免劇烈振蕩,充分混合均勻后,37℃水浴30min。加入25μL20%SDS和5μL20mg/mL蛋白酶K,避免劇烈振蕩,充分混合均勻后,55℃水浴2h以上,加入0.1g玻璃珠(直徑212~300μm,美國SIGMA),于labnet230VEU渦旋儀(美國labnet)以最高轉(zhuǎn)速振蕩5min,將管子放置于研缽中,加入液氮覆蓋,待液體全部凍住后放入55℃水浴鍋中融化,重復3次。加入80μL5mol/LNaCl,小心混勻后,加入60μL10%CTAB/NaCl,小心混勻,65℃水浴20min。加入700μL苯酚:氯仿:異戊醇(體積比25∶24∶1),顛倒混勻后于4000r/min離心20min,將上層水相轉(zhuǎn)移至新的2mL離心管中,加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1,體積比),顛倒混勻后于4000r/min離心20min。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的2mL離心管中,加入0.6體積的異丙醇,-20℃沉淀過夜后于12000r/min離心15min,倒掉液體,用500μL預冷的70%乙醇洗沉淀,去掉液體后,將離心管打開蓋子,置于60℃烘干箱干燥,待液體全部揮發(fā)后取出,加入120μLTE(10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0))緩沖液溶解DNA。提取好的DNA存放于-20℃。1.2.2細菌16SrRNA基因擴增和焦磷酸測序使用細菌的16SrRNA基因通用引物對提取的DNA進行擴增。擴增使用通用引物338F(5’-ACHYCTACGGGAGGCHGC-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3’),并在引物338F的5’末端添加8個堿基的標記和焦磷酸測序的AdapterA,在907R的5’末端添加AdapterB。為了減少PCR產(chǎn)物中非特異性擴增的異源雙鏈DNA的含量,將PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模版后按照原來的條件再做5個循環(huán)。PCR擴增采用PremixExTaqTM(大連TaKaRa),具體體系及程序如下:1)PCR反應體系:ddH2O18μL;Forward引物(5μmol/L)2μL;Reverse引物(5μmol/L)2μL;PremixExTaqTM25μL;模板(15ng)3μL;總體積50μL。2)PCR擴增程序:95℃預變性5min;94℃變性1min;56℃退火1min;共30個循環(huán)。72℃延伸1min30s;72℃延伸7min。將PCR產(chǎn)物在1g/dL的瓊脂糖凝膠中電泳,電泳后將凝膠浸泡于含有20μg/mLEB的TAE緩沖液中,10min后在紫外燈(216nm)照射下呈現(xiàn)橙色條帶,目標條帶割下后使用QIAquickGelExtractionKit(德國Qiangen)對PCR產(chǎn)物進行回收。使用nanodropND-1000分光光度計(美國Thermo)對完成純化的PCR擴增產(chǎn)物定量。使用GS-FLX(瑞士Roche)測序系統(tǒng)對DNA進行測序。1.2.3測序結果分類鑒定對于焦磷酸測序的測序結果分析質(zhì)量文件,去掉測序質(zhì)量不好的序列,并對序列長度進行篩選,刪掉長度小于300bp的序列,根據(jù)barcode將序列確定為本樣品的序列,并去除barcode和引物序列,得到有效的序列文件。使用Mallardv1.02來檢測PCR產(chǎn)物序列中的嵌合體。使用mothurv1.25.1的classify.seqs命令,采用Silva的核糖體小亞基(SSU)rRNA序列數(shù)據(jù)庫V102的分類信息,得到序列的分類信息,分別采用80%的閾值(threshold)。1.2.4多樣性指數(shù)和系統(tǒng)發(fā)育分析對所有序列使用mothurv1.25.1進行比對,以0.03為cutoff值劃分可操作分類單元(operationaltaxonomicunit,OTU)。計算cutoff為0.03時的ACE和Chao1值,并繪制rarefaction曲線。從細菌16SrRNA基因序列中每個OTU選取代表序列,將其在NCBI的GenBank進行Blast比對,將結果中具有確定分類信息的序列用ClustalX1.83進行比對,將比對的結果用Megav4.0中的Neighbour-joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。2結果與分析2.1raefcdity分析經(jīng)過對焦磷酸測序所得序列進行質(zhì)量和長度刪選,得到356條高質(zhì)量序列。對這些序列以0.03為cutoff進行分析,共得到62個OTU,其中,singleton42個,doubleton7個。ACE值為387,Chao1值為170,rarefaction曲線見圖1。可見OTU數(shù)目隨著序列數(shù)上升的趨勢還遠未達到平臺期。2.2壁菌門中序列的分類根據(jù)Silva的SSUrRNA序列數(shù)據(jù)庫對序列進行分類,在356條序列中,有91%(324條)的序列屬于厚壁菌門(Firmicutes),9%(32條)的序列屬于變形菌門(Proteobacteria)。在厚壁菌門中,占總序列72%(258條)的序列屬于乳桿菌科(Lactobacillaceae),10%(36條)的序列屬于芽孢桿菌科(Bacillaceae),4%(15條)的序列屬于肉桿菌科(Carnobacteriaceae);在變形菌門中,所有的序列都屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae),2%的序列不能確定分類信息(圖2(a))。在屬這一分類水平上,總序列的72%(256條)的序列都屬于乳酸桿菌屬(Lactobacillus),8%(28條)的序列屬于芽孢桿菌屬(Bacillus),而腸桿菌科的序列則大多屬于腸道菌簇(Enteric_Bacteria_cluster),3%的序列不能確定分類信息(圖2b)。2.3芽孢桿菌屬和ymfm、dp以0.03為cutoff,對356條序列進行序列比對和距離矩陣分析,確定了62個OTU,將其中的singleton和doubleton去除后,還有13個OTU,將其與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對,并下載相近序列共同構建系統(tǒng)發(fā)育樹,見圖3。豐度最高的OTU是YM_QT,占了總序列數(shù)的64%,經(jīng)過比對,它與乳酸桿菌科的L.acidifarinae和L.zymae都有大于97%的相似度。豐度第二高的是OTUYM_DT,有11條序列,在系統(tǒng)發(fā)育樹上并未與已知分類信息的細菌呈現(xiàn)較高的相似度,但是可以確定分在芽孢桿菌屬中。有10條序列屬于OTUYM_P8,也屬于芽孢桿菌屬,與B.thermoamylovorans有98%的相似度。另有兩個OTU,YM_FM和YM_DP,均含有9條序列,雖然在系統(tǒng)發(fā)育樹上可以歸入乳酸桿菌屬,但是不能與已知分類信息的乳酸桿菌聚類在一起。在變形菌門中,有兩個OTU,其中YM_W2中有8條序列,與Erwiniapersicina有99%以上的相似度,而YM_JS只有3條序列,與Shigellaflexneri較為相似。雖然在屬的水平只有3%的序列不能確定分類信息,但是對于豐度較高的OTU,還是有約占總序列數(shù)10%的序列不能確定到種的水平。3易門豌豆的細菌類型及致病性近年來,食品發(fā)酵中的微生物變化受到關注并得到了研究,科學家們通過rRNA基因序列分析的方法研究了如泡菜、發(fā)酵的芥末醬和發(fā)酵乳品等世界各地不同的發(fā)酵食品的微生物群落多樣性,作者對云南特色的豆豉中細菌群落多樣性進行了研究,使用高通量焦磷酸測序技術,得到了356條序列,較為充分地展示了豆豉中細菌群落結構。通過多樣性指數(shù)和rarefaction曲線的結果可以看出,這一樣品細菌群落的多樣性是非常高的,因此,為了分析豆豉中的稀有群落(rarebiosphere),使用高通量測序分析群落結構是必須的。在本研究中,約10%的序列不能確定具體的分類信息,有2%的序列甚至不能確定到科,這說明豆豉雖然為富營養(yǎng)環(huán)境,含有較多的可培養(yǎng)細菌,但是仍有一部分細菌為目前不能培養(yǎng)的細菌類型。在他人的研究中,傳統(tǒng)豆豉的生產(chǎn)有很大的地域性差異,大多豆豉為真菌(霉菌)型豆豉,而在本研究中,雖然對易門豆豉采用溶壁酶共同提取了真菌的DNA,在對真菌轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列擴增時則未得到相應條帶,因此,易門豆豉應該是以細菌起主要作用的細菌型豆豉。在本研究分析的豆豉樣品中,大多數(shù)序列都集中在乳酸桿菌中,作為主要的乳酸菌種類,乳酸桿菌屬的細菌在多種發(fā)酵食品中檢測到并發(fā)揮重要作用。作為乳酸桿菌中豐度最高的OTU,YM_QT與L.acidifarinae和L.zymae都顯示了很高的相